植物JAZ蛋白及衍生多肽在预防和人与动物肿瘤中的应用

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植物JAZ蛋白及衍生多肽在预防和人与动物肿瘤中的应用
植物jaz蛋白及衍生多肽在预防和人与动物肿瘤中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域,具体涉及植物jaz蛋白及衍生多肽在预防和人与动物肿瘤中的应用。


背景技术:



2.植物愈伤组织培养是基因编辑技术育种过程中的关键技术环节之一。植物愈伤组织是植物在遇到逆境受伤后,在伤口愈合过程中会产生生理性的赘瘤,是一团无定形的薄壁细胞,丧失了原有的结构和功能,重新恢复了分裂能力,可以无限增殖。植物可以产生“肿瘤”愈合伤口,并且在伤口愈合后细胞的快速增殖即会被抑制,而不会发生恶性增殖的现象。在植物愈伤组织(植物肿瘤)发展过程中,ja信号通路是调控植物“肿瘤”发展,促进伤口愈合的关键信号通路,植物特有的jaz蛋白是茉莉酸信号通路的唯一负调控因子,是阻止“植物肿瘤”发展的关键因子。jaz蛋白是植物特有蛋白,在棉花中较多。在进行组织培养时发现过表达棉花jaz可以抑制棉花愈伤组织的生长,ja抑制剂同时也可抑制棉花愈伤组织的生长,且jaz对ja信号的抑制是通过抑制myc的转录因子功能来实现的。
[0003]“植物肿瘤”与人类肿瘤相似,如形态相似、均受外源刺激诱导产生、细胞分裂快、增殖迅速、都受转录因子myc的调控等。“植物肿瘤”的生长被ja信号严格调控而不能恶性发展,而与具有可控性的“植物肿瘤”不同的是,人类肿瘤往往会因为不可控性而恶化发展为癌症。癌症严重影响人类健康,探索癌症发生机制、开发癌症策略刻不容缓。原癌基因myc的激活与多种类型癌症的发生发展相关,是研究最广泛的癌基因。鉴于myc在癌症发生发展中起到的关键作用,筛选靶向并抑制myc活性的药物是恶性肿瘤的重要策略。目前,靶向myc的药物,研究最多的是抑制myc/max的相互作用,如小分子抑制剂mycro 3、si-3716、mycmi-6、sajm589等,多肽药物omomyc,天然产物stauprimide、lusianthridin等。由于myc与max可以形成四个螺旋束组成的复杂结构,靶点间互动复杂,基于这一结构进行药物研发较为困难,寻易于生产且能有效抑制myc的天然蛋白意义重大。


技术实现要素:



[0004]
本发明的目的是提供一种肿瘤预防和的新药物,即jaz蛋白、jaz同源蛋白及其衍生多肽等,其在肿瘤预防和中具有重要的药物应用价值。
[0005]
本发明要解决的技术问题是克服基于人和动物肿瘤中原癌基因mycs(c-myc、nmyc、lmyc)靶点间互动复杂进行药物研发较为困难等问题,旨在针对长久以来肿瘤对人和动物的危害性探究预防和肿瘤的药物。
[0006]
本发明提出一种基于多靶点抗肿瘤的机制和天然产物,解决了传统肿瘤药物靶点单一、耐药性、效率低等问题。
[0007]
第一方面,本发明要求保护a)或b)或c)或d)在如下p1-p4任一中的应用:
[0008]
a)、植物jaz蛋白。
[0009]
b)、所述植物jaz蛋白的衍生多肽。
[0010]
c)、a)中所述植物jaz蛋白或b)中所述衍生多肽的修饰产物;所述修饰产物可为所述植物jaz蛋白或所述衍生多肽经如下任一修饰后所得产物:糖基化、磷酸化、n-甲基化、豆蔻酰化、棕榈酰化、生物素化、荧光标记、聚乙二醇(peg)修饰、多聚抗原肽(map)、异戊二烯化环化、环化等修饰。
[0011]
d)、a)中所述植物jaz蛋白或b)中所述衍生多肽的相关生物材料;所述相关生物材料为如下任一:1)编码所述植物jaz蛋白或所述衍生多肽的核酸分子;2)含有所述核酸分子的表达盒、表达载体或重组微生物。
[0012]
p1、制备用于和/或预防人或动物肿瘤的产品。
[0013]
p2、制备用于抑制人或动物肿瘤的发生和/或发展的产品。
[0014]
p3、制备用于抑制人或动物肿瘤细胞增殖的产品。
[0015]
p4、制备用于促进人或动物肿瘤细胞凋亡的产品。
[0016]
在该应用中,所述植物jaz蛋白能够与人或动物的myc蛋白互作。
[0017]
进一步地,所述myc蛋白可为c-myc蛋白、nmyc蛋白和/或lmyc蛋白。具体而言,所述植物jaz蛋白可依靠nt结构域与c-myc蛋白的n端互作。
[0018]
在该应用中,所述植物jaz蛋白具有如下功能中的全部或部分:将人或动物肿瘤细胞的细胞周期阻滞在g2-m期;调控人或动物肿瘤细胞中c-myc下游基因;与癌细胞表面受体upar互作(所述植物jaz蛋白可依靠nt结构域与upar的d3结构域互作);与癌细胞表面受体upar的配体upa互作(与upa的atf结构域互作);进入人或动物肿瘤细胞的细胞核。
[0019]
在本发明中,所述调控c-myc下游基因具体体现为如下中的全部或部分:c-myc下游的凋亡相关基因bcl2、bax、hk2、fasn、mcm5下调,p21基因上调;细胞周期相关基因ccna2、ccnb1、ccnd1下调,ccne1上调。
[0020]
进一步地,所述植物jaz蛋白的衍生多肽可为所述植物jaz蛋白的nt结构域、zim结构域或jas结构域,或含有所述植物jaz蛋白的nt结构域、zim结构域或jas结构域的多肽。
[0021]
在本发明的具体实施方式中,所述植物jaz蛋白具体为来源于棉花的jaz蛋白。
[0022]
进一步地,所述来源于棉花的jaz蛋白可为如下任一:
[0023]
(a1)氨基酸序列如seq id no.1至seq id no.35中任一所示的蛋白质;
[0024]
(a2)将(a1)中所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且来源于棉花具有相同功能的蛋白质;
[0025]
(a3)与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上或者80%以上同一性且来源于棉花具有相同功能的蛋白质;
[0026]
(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
[0027]
上述蛋白质中,所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术,与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白,以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
[0028]
上述蛋白质中,同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性,如ncbi主页网站的blast网页。例如,可在高级blast2.1中,通过使用blastp作为程序,将expect值设置为10,将所有filter设置为off,使
用blosum62作为matrix,将gap existence cost,per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11,1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算,然后即可获得同一性的值(%)。
[0029]
上述蛋白质中,所述95%以上的同源性可为至少96%、97%、98%的同一性。所述90%以上的同源性可为至少91%、92%、93%、94%的同一性。所述85%以上的同源性可为至少86%、87%、88%、89%的同一性。所述80%以上的同源性可为至少81%、82%、83%、84%的同一性。
[0030]
相应的,编码所述植物jaz蛋白(即所述来源于棉花的jaz蛋白)的核酸分子可为如下任一:
[0031]
(b1)seq id no.36至seq id no.70中任一所示的dna分子;
[0032]
(b2)在严格条件下与(b1)限定的dna分子杂交且编码所述来源于棉花的jaz蛋白的dna分子;
[0033]
(b3)与(b1)-(b2)中任一限定的dna序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上或者80%以上同源性且编码所述来源于棉花的jaz蛋白的dna分子。
[0034]
seq id no.36至seq id no.70所示dna分子依次编码seq id no.1至seq id no.35所示蛋白质。
[0035]
上述核酸分子中,所述严格条件可为如下:50℃,在7%十二烷基硫酸钠(sds)、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交,在50℃,2
×
ssc,0.1%sds中漂洗;还可为:50℃,在7%sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交,在50℃,1
×
ssc,0.1%sds中漂洗;还可为:50℃,在7%sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交,在50℃,0.5
×
ssc,0.1%sds中漂洗;还可为:50℃,在7%sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交,在50℃,0.1
×
ssc,0.1%sds中漂洗;还可为:50℃,在7%sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交,在65℃,0.1
×
ssc,0.1%sds中漂洗;也可为:在6
×
ssc,0.5%sds的溶液中,在65℃下杂交,然后用2
×
ssc,0.1%sds和1
×
ssc,0.1%sds各洗膜一次。
[0036]
上述核酸分子中,同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性,如ncbi主页网站的blast网页。例如,可在高级blast2.1中,通过使用blastp作为程序,将expect值设置为10,将所有filter设置为off,使用blosum62作为matrix,将gap existence cost,per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11,1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算,然后即可获得同一性的值(%)。
[0037]
上述核酸分子中,所述95%以上的同源性可为至少96%、97%、98%的同一性。所述90%以上的同源性可为至少91%、92%、93%、94%的同一性。所述85%以上的同源性可为至少86%、87%、88%、89%的同一性。所述80%以上的同源性可为至少81%、82%、83%、84%的同一性。
[0038]
进一步地,所述人或动物肿瘤包括但不限于如下:卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌等。
[0039]
进一步地,所述人或动物肿瘤细胞包括但不限于如下:卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞等。
[0040]
在本发明的具体实施方式中,所述卵巢癌细胞为skov3细胞;所述乳腺癌细胞为
mcf7细胞;所述宫颈癌细胞为hela细胞;所述肺癌细胞为a549细胞。
[0041]
在上述应用中,所述产品可为药物。
[0042]
进一步地,所述药物为在所述a)或所述b)或所述c)的基础上,加入药学上可接受的辅料(例如赋形剂、稀释剂等)制备而成的。
[0043]
进一步地,所述药物也可为复方药物或辅助药物。
[0044]
更进一步地,所述药品可为适用于口服给药的片剂、胶囊剂、颗粒剂或糖浆剂等,或适用于注射给药的粉针剂或溶液剂。
[0045]
第二方面,本发明要求保护前文第一方面中所述a)或所述b)或所述c)或所述d)在抑制植物愈伤组织生长中的应用。
[0046]
进一步地,所述植物愈伤组织为棉花愈伤组织。
[0047]
在本发明的具体实施方式中,外植体为根段或下胚轴。
[0048]
在该应用中,所述植物jaz蛋白具有如下功能中的全部或部分:在植物体内,与ninja蛋白、tpl蛋白、hda6蛋白均有相互作用;在ja-ile存在时,与coi1蛋白有相互作用;能够与myc2蛋白、ninja蛋白、tpl蛋白形成复合体。
[0049]
在本发明的具体实施方式中,所述植物为棉花。
[0050]
第三方面,本发明要求保护ja合成抑制剂在抑制植物愈伤组织生长中的应用。
[0051]
在本发明的具体实施方式中,所述ja合成抑制剂为铜试剂dicea或布洛芬。
[0052]
进一步地,所述植物愈伤组织为棉花愈伤组织。
[0053]
在本发明的具体实施方式中,外植体为根段或下胚轴。
[0054]
第四方面,本发明要求保护一种抑制植物愈伤组织生长的方法。
[0055]
本发明要求保护的抑制植物愈伤组织生长的方法,是以前文第一方面中所述a)或所述b)或所述c)或所述d)或前文第三方面中所述ja合成抑制剂抑制植物愈伤组织生长。
[0056]
在本发明的具体实施方式中,所述植物愈伤组织为棉花愈伤组织。
[0057]
进一步地,所述方法可包括如下步骤:
[0058]
实验组:在目的植物中过表达前文第一方面中所述植物jaz蛋白或所述衍生多肽,得到转基因阳性植株;从所述转基因阳性植株上取外植体进行组培,得到愈伤组织;
[0059]
对照组:与所述实验组的差别仅在于进行组培时所取的外植体来自于未转基因的所述目的植物;
[0060]
所述实验组的愈伤组织生长速度慢于所述对照组。
[0061]
或者,
[0062]
进一步地,所述方法可包括如下步骤:
[0063]
实验组:从目的植物上取外植体置于添加有所述ja合成抑制剂的愈伤组织诱导培养基上进行组培,得到愈伤组织;
[0064]
对照组:与所述实验组的差别仅在于进行组培时采用的愈伤组织诱导培养基中不含有所述ja合成抑制剂;
[0065]
所述实验组的愈伤组织生长速度慢于所述对照组。
[0066]
在本发明的具体实施方式中,所述外植体为根段或下胚轴。
[0067]
当所述ja合成抑制剂为铜试剂dicea时,其在愈伤组织诱导培养基中的终浓度可为200-800μm,如200μm、400μm或800μm;当所述ja合成抑制剂为布洛芬时,其在愈伤组织诱
导培养基中的终浓度为20-80μm,如20μm、40μm或80μm。
[0068]
由于棉花自古以来就有作为中药的传统(《本草纲目》等均有记载),且棉花中jaz众多。植物特有的jaz蛋白可以在植物中阻断myc等转录因子的活性,而myc在进化上高度保守。据此,本发明提出棉花jaz蛋白、jaz同源蛋白及其衍生多肽和以上蛋白与多肽的修饰产物通过抑制人和动物原癌基因mycs(c-myc、nmyc、lmyc)来抑制人和动物肿瘤,达到预防和肿瘤的目的。
[0069]
实验证明:棉花jaz蛋白、植物jaz同源蛋白及其衍生多肽对人源乳腺癌mcf7、卵巢癌skov3、宫颈癌hela、肺癌a549等肿瘤细胞系均有显著抑制作用;jaz蛋白及其衍生多肽对小鼠活体肿瘤的发生发展有显著的抑制作用。蛋白互作实验(酵母双杂、免疫共沉淀、下拉实验、双分子荧光互补、luc实验)证实jaz蛋白及其衍生多肽与人源原癌基因mycs(c-myc、nmyc、lmyc)存在强互作。综上,jaz蛋白及其衍生多肽可靶向多种类型的人和动物肿瘤,能够开发成为人和动物肿瘤靶向药物。本发明为多种人和动物肿瘤提供新型的药物或辅助药物。
附图说明
[0070]
图1为ghjazs的过量表达抑制棉花愈伤组织的生长。a、“中棉所24”(wt)和在“中棉所24”中过量表达ghjaz9的愈伤组织(左侧为对照wt,右侧为过表达ghjaz9材料),bar=1cm;b、野生型“中棉所24”愈伤放大图,bar=0.3cm;c、过量表达ghjaz9的愈伤放大图,bar=0.3cm;d、野生型和过表达转基因株系中ghjaz9基因的基因表达分析;e、野生型和过表达转基因株系愈伤重量统计;f、野生型和过表达发根棉花中ghjaz1基因的基因表达分析;g、野生型和过表达发根棉花根愈伤重量统计;h、野生型和过表达转基因株系愈伤的细胞周期基因表达分析。
[0071]
图2为添加外源ja合成抑制剂可以显著抑制棉花愈伤组织生长。a、正常培养基上生长5周的“中棉所24”愈伤;b、在含有dieca培养基上生长5周的“中棉所24”愈伤;c、添加布洛芬的培养基上生长5周的中棉所24的愈伤;d、生长5周的愈伤的重量统计结果(ibu表示布洛芬);e、愈伤中ja的含量检测(ibu表示布洛芬);f、dieca的培养基上的愈伤的细胞周期基因的表达;g、含有布洛芬培养基上愈伤组织细胞周期基因的表达验证。bar=0.2cm。图中,dieca-1、dieca-2和dieca-3分别表示在愈伤诱导培养基中添加量依次为200μm、400μm和800μm的三组;ibu-1、ibu-2和ibu3分别表示在愈伤诱导培养基中添加量依次为20μm、40μm和80μm的三组。
[0072]
图3为jaz基因在各种生物中的分布和进化树。a、生物界jaz蛋白的进化分布;b、拟南芥和棉花中jaz蛋白的系统进化分析。
[0073]
图4为生物界myc的进化及保守结构域分析。a、生物界myc蛋白的进化分布;b和c、myc蛋白的保守结构域分析。
[0074]
图5为棉花jaz蛋白转录抑制复合物中主要蛋白与jaz的互作关系。a、棉花jaz与myc2的酵母双杂互作筛选(ad代表酵母双杂交的pgadt7空载;bd代表酵母双杂交的pgbkt7空载,相当于阴性对照);b、ghjaz1与ghmyc2的荧光素酶实验验证互作;c、ghjaz9与ghmyc2的荧光素酶实验验证互作;d、ghjaz1和jaz1分别缺失nt、zim、jas的突变体(图中标注δnt、δzim、δjas的分别表示缺失相应结构域)与ghmyc2、ghninja、ghtpl、ghhda6、ghcoi1相互
作用的验证(上侧为培养基中无ja-ile,下侧为培养基中添加ja-ile)。e、ghjaz1与ghninja的荧光素酶实验验证互作;f、ghjaz1与ghcoi1的荧光素酶实验验证互作;g、ghjaz1与ghtpl的coip实验验证互作;h、ghjaz1与ghhda6的coip实验验证互作。
[0075]
图6为棉花jaz与原癌基因myc的直接相互作用。a、植物“肿瘤”与动物肿瘤的相似点;b、棉花jaz与myc原癌基因的酵母双杂互作筛选(ad代表酵母双杂交的pgadt7空载;bd代表酵母双杂交的pgbkt7空载,相当于阴性对照);c、pull down验证ghjaz1与c-myc互作;d、co-ip验证ghjaz1与c-myc互作;e、co-ip验证ghjaz1与nmyc互作;f、luc实验验证ghjaz1与c-myc互作;g、双分子荧光互补验证ghjaz1与c-myc互作。bar=50μm。
[0076]
图7为ghjaz1蛋白抑制癌细胞的增殖。a、wb检测ghjaz1-his蛋白表达;b、ghjaz1对mcf7细胞的作用,ic50=0.691μm;c、ghjaz1对mcf10a细胞的作用,无抑制作用;d-g、pbs处理乳腺癌细胞mcf7;h-k、ghjaz1蛋白处理乳腺癌细胞mcf7(d和h:明场下拍照;e和i:红荧光下拍照,红显示的是凋亡细胞;f和j、绿荧光下拍照,绿显示的是活细胞;g和k:红荧光和绿荧光融合后的结果);l、ghjaz1蛋白对a549细胞的作用,ic50=0.697μm;m、ghjaz1蛋白对hela细胞的作用,ic50=0.553μm;n、ghjaz1蛋白对skov3细胞的作用,ic50=0.784μm。bar=100μm。
[0077]
图8为ghjaz1蛋白对癌细胞和正常细胞的细胞凋亡、细胞周期的影响。a-c、ghjaz1蛋白对mcf7细胞凋亡的影响;d-f、ghjaz1蛋白对mcf10a细胞凋亡的影响;g-i、ghjaz1蛋白对mcf7细胞周期的影响;j-l、ghjaz1蛋白对mcf10a细胞周期的影响。其中a、d、g、j为对照组(添加pbs),b、e、h、k为ghjaz1处理组,c、f、i、l为统计数据。
[0078]
图9为ghjaz1对c-myc下游基因的调控。a、pbs和ghjaz1蛋白处理后的mcf7细胞转录组差异基因热图分析;b、pbs和ghjaz1蛋白处理后的mcf7细胞中差异基因表达量检测;c、pbs和ghjaz1蛋白处理后的mcf7细胞中c-myc下游基因表达量检测;d、pbs和ghjaz1蛋白处理后的mcf10a细胞中c-myc下游基因表达量检测。
[0079]
图10为ghjaz1与癌细胞表面受体的直接互作关系。a、ghjaz1与癌细胞表面受体的酵母互作筛选(ad代表酵母双杂交的pgadt7空载;bd代表酵母双杂交的pgbkt7空载,相当于阴性对照);b、ghjaz1与癌细胞表面受体upar的coip互作验证;c和d、upar和ghjaz1分别与upa的atf结构域的互作分析。
[0080]
图11为ghjaz1蛋白进入细胞及细胞核的实验验证。a、ghjaz1+rfp-his蛋白wb检测。泳道m:蛋白质印迹标记;泳道nc:无诱导细胞裂解物;泳道1:在15℃下诱导16小时的细胞裂解物;泳道2:在37℃下诱导4小时的细胞裂解物;泳道3:15℃诱导16小时的细胞裂解液上清液;泳道4:细胞裂解液的上清液,在37℃下诱导4小时;泳道5:在15℃下诱导16小时的细胞裂解物碎片;泳道6:在37℃下诱导4小时的细胞裂解物碎片。免疫印迹的一抗是抗组氨酸抗体(genscript,a00186);b-e、pbs处理乳腺癌细胞mcf7;f-i,irp-803(upar抑制剂)处理乳腺癌细胞mcf7;j-m、ghjaz1蛋白处理乳腺癌细胞mcf7(b、f和j:明场下拍照;c、g和k:蓝荧光下拍照,蓝显示的是细胞核;d、h和l:红荧光下拍照,h显示的是irp-803在细胞核外发红荧光,l显示的是ghjaz1+gfp的红荧光,是点状分布的;e、i和m:蓝荧光和红荧光融合后的结果)。
[0081]
图12为ghjaz1蛋白抗活体肿瘤实验结果。a、打药组和对照组活体肿瘤拍照;b、打药组和对照组活体肿瘤体积统计;c、打药组和对照组活体肿瘤拍照;d、打药组和对照组活
体肿瘤重量统计。
[0082]
图13为ghjaz1与upar、c-myc互作结构域实验结果。a、ghjaz1和ghjaz1缺失nt、zim、jas结构域酵母载体分别与upar和upa的atf结构域酵母双杂交互作分析;b、upar和upar缺失d1、d2、d3结构域酵母载体分别与ghjaz1的互作分析;c、ghjaz1和ghjaz1缺失nt、zim、jas结构域酵母载体分别与c-myc和nmyc全长的互作分析;d、c-myc和c-myc截短前150个氨基酸、截短前215个氨基酸分别与ghjaz1的互作分析;e、c-myc和c-myc截短前150个氨基酸、截短前215个氨基酸分别与ghjaz1的luc互作验证。
具体实施方式
[0083]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0084]
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0085]
实施例1、过表达棉花jaz对愈伤生长的影响分析
[0086]
1、过表达ghjaz1转基因材料的创制
[0087]
根据拟南芥jaz1氨基酸序列在棉花数据库中进行全长和结构域保守分析,分析出与atjaz1同源性最高的棉花jaz1,基因号为gh_a05g0260,序列如seq id no.4所示。将ghjaz1全长cds(seq id no.39)连接到改造后的pcambia2300(pcambia2300原始载体为优宝生物产品,货号:vt1383,具体改造为:将pcambia2300原始载体的mcs区域替换为2x35s-yfp序列,2x35s-yfp序列如seq id no.89所示)的xbai和paci酶切位点之间,将经测序验证正确后的重组阳性质粒转化农杆菌k599,以棉花“中棉所24”为材料,利用发根农杆菌介导的遗传转化技术创制发根棉花转基因材料。依次为培养无菌苗、制备子叶、农杆菌液浸染棉花子叶,然后生出根。将获得的抗性根进行rna水平的鉴定。
[0088]
rna水平鉴定:利用rna提取试剂盒(rnaprep pure多糖多酚植物总rna提取试剂盒(dp441),厂家:天根生化科技(北京)有限公司)提取rna,然后利用两步法反转录试剂盒获得cdna(去基因组与逆转录两步进行的三代预混液,货号mr05201),以cdna为模板,加入96孔板中,并添加green i嵌合染料(抗体染料法定量pcr预混液,货号mq10101)以及基因引物进行三步法qpcr扩增,最后根据ct值计算基因相对表达量。
[0089]
以actin为内参,检测引物:
[0090]
q-actin-f:5
’‑
gacccagatcatgtttgagacct-3’;
[0091]
q-actin-r:5
’‑
cagtgtggctgacaccatcac-3’。
[0092]
用于检测ghjaz1的引物:
[0093]
q-ghjaz1-f:5
’‑
gatgatagtcccaacaagttggagcc-3’;
[0094]
q-ghjaz1-r:5
’‑
tcgcttctctaggaaccgatgca-3’。
[0095]
结果显示:oeghjaz1-1和oeghjaz1-8与对照相比极显著升高,为对照的70-300倍(图1中f)。其中,oeghjaz1-1和oeghjaz1-8为从转基因后代中随机选取的两个阳性株系。
[0096]
2、过表达ghjaz9转基因材料的创制
[0097]
根据拟南芥jaz9氨基酸序列在棉花数据库中进行全长和结构域保守分析,分析出与atjaz9同源性最高的棉花jaz9,序列如seq id no.2所示。将ghjaz9全长cds(seq id no.37)连接到载体8/gw/topo(invitrogen,货号:k252020)ecori和ecori之间,通过lr反应(thermofisher,gateway lr clonase enzyme mix,货号11791019)连接到pearleygate 303载体(优宝生物,货号:vt9027)上,将经测序验证正确后的重组阳性质粒转化农杆菌lba4404,以棉花“中棉所24”为材料,利用农杆菌介导的遗传转化技术创制转基因材料。依次为培养无菌苗、制备外植体,农杆菌液浸染棉花的外植体,然后经过脱分化形成抗性愈伤组织,再生成苗,最后获得抗性植株。将获得的抗性植株进行rna水平鉴定。rna鉴定方法同上,用于检测ghjaz9的引物如下:
[0098]
q-co39-f1:5
’‑
cttcatgcctatatcaacaatggatgct-3’;
[0099]
q-co39-r1:5
’‑
caagggtgggaagaactgaatgtg-3’。
[0100]
结果显示:oeghjaz9-2、oeghjaz9-3和oeghjaz9-6的表达量与对照相比均极显著升高(图1中d)其中,oeghjaz9-2、oeghjaz9-3和oeghjaz9-6为从转基因后代中随机选取的三个阳性株系。
[0101]
3、过表达棉花jaz对愈伤生长的影响
[0102]
将经步骤1鉴定得到的ghjaz1过表达阳性根和阴性根(即转pcambia2300空载的中棉所24的根)切断形成长度一致的外植体,且放置在同一培养皿中同时进行培养。一个月后观察愈伤的生长情况,并进行相机和显微镜拍照、统计愈伤的重量、取材进行荧光定量pcr检测细胞周期相关基因的表达。
[0103]
rna提取、反转录和荧光定量pcr步骤同上,引物序列为:
[0104]
用于检测ghcyca1的引物:
[0105]
q-ghcyca1-1-f:5
’‑
gtacaacccggttcagttccg-3’;
[0106]
q-ghcyca1-1-r:5
’‑
gaatcaacagccgtaacatcatg-3’。
[0107]
用于检测ghcyca2的引物:
[0108]
q-ghcyca2-4-f:5
’‑
gcacttaatggtcgaatcacacgt-3’;
[0109]
q-ghcyca2-4-r:5
’‑
attattgcagcaaacatttgtgacat-3’。
[0110]
用于检测ghcycb的引物:
[0111]
q-ghcycb-f:5
’‑
ggctcagattcagactcatcgtc-3’;
[0112]
q-ghcycb-r:5
’‑
cagcaggagcagcaacacttc-3’。
[0113]
用于检测ghcycd1-1的引物:
[0114]
q-ghcycd1-1-f:5
’‑
cttcacggacttactctgcgc-3’;
[0115]
q-ghcycd1-1-r:5
’‑
cactgaaaccgagcaaggtaatc-3’。
[0116]
用于检测ghcycd3-1的引物:
[0117]
q-ghcycd3-1-f:5
’‑
atggcaatacagcaatatgaacagc-3’;
[0118]
q-ghcycd3-1-r:5
’‑
cctgctctaacaacaacagtggg-3’。
[0119]
用于检测ghcycd6-1的引物:
[0120]
q-ghcycd6-1-f:5
’‑
acccattaacaaacttcgatgactt-3’;
[0121]
q-ghcycd6-1-r:5
’‑
tcgagataattgacagcaagatacg-3’。
[0122]
用经步骤2鉴定得到的纯合的ghjaz9过表达转基因株系的种子和“中棉所24”种子
no.35所示,对应的编码基因依次如seq id no.36至seq id no.70所示),根据进化分析可将其主要分为以ghjaz1、ghjaz9、ghjaz7、ghjaz10、ghjaz11和ghjaz31为代表的6大类(图3中b)。
[0135]
myc属于生物界普遍存在的bhlh转录因子家族,从进化关系来看,myc存在于病毒、原核生物和真核生物中(图4中a)。植物中研究最多的是myc2,它充当ja信号通路内的调节枢纽。在myc2的羧基结构域中包含保守的bhlh结构域,能与其它蛋白形成同源二聚体或异源二聚体,并与目标基因启动子中的g-box(5'-cacgtg-3')结合。myc2在其氨基末端含有一个转录激活域(tad),通过其tad募集转录起始所需的介体复合物,该复合物与植物介体复合物med25特异性相互作用。从氨基酸同源比对的结果来看,myc在tad和bhlh结构域较保守(图4中b和c)。
[0136]
2、jaz基因在棉花中与其互作的蛋白及蛋白复合体研究
[0137]
拟南芥研究表明jaz蛋白对ja信号的抑制主要是是通过抑制myc的转录因子功能来实现,我们在棉花中对此结果进行了实验验证。根据拟南芥和棉花jaz的进化树,我们筛选出6个棉花jaz(ghjaz1、ghjaz7、ghjaz9、ghjaz10、ghjaz11、ghjaz31)与ghmyc2、ghninja、ghtpl、ghhda6、ghcoi1进行酵母双杂分析。ghjaz1的氨基酸序列如seq id no.4所示,对应的编码基因序列如seq id no.39所示;ghjaz7的氨基酸序列如seq id no.7所示,对应的编码基因序列如seq id no.42所示;ghjaz9的氨基酸序列如seq id no.2所示,对应的编码基因序列如seq id no.37所示;ghjaz10的氨基酸序列如seq id no.3所示,对应的编码基因序列如seq id no.38所示;ghjaz11的氨基酸序列如seq id no.5所示,对应的编码基因序列如seq id no.40所示;ghjaz31的氨基酸序列如seq id no.9所示,对应的编码基因序列如seq id no.44所示。ghmyc2的基因编号为gh_a12g1893(/);ghninja的基因编号为gh_d05g0252(/);ghtpl的基因编号为gh_d05g1161(/);ghhda6的基因编号为gh_d03g0986(/);ghcoi1的基因编号为gh_a05g2749(/)。
[0138]
酵母双杂实验方法:使用bamh1和ecor1限制性内切酶构建pgbkt7::ghjaz1(seq id no.39所示dna片段插入到pgbkt7质粒的bamh1和ecor1之间)、pgbkt7::ghjaz9(seq id no37所示dna片段插入到pgbkt7质粒的bamh1和ecor1之间)、pgbkt7::ghjaz7(seq id no.42所示dna片段插入到pgbkt7质粒的bamh1和ecor1之间)、pgbkt7::ghjaz10(seq id no.38所示dna片段插入到pgbkt7质粒的bamh1和ecor1之间)、pgbkt7::ghjaz11(seq id no.40所示dna片段插入到pgbkt7质粒的bamh1和ecor1之间)、pgbkt7::ghjaz31(seq id no.44所示dna片段插入到pgbkt7质粒的bamh1和ecor1之间)、pgbkt7::ghjaz1
δnt
(seq id no.74所示ghjaz1
δnt
基因序列插入到pgbkt7质粒的bamh1和ecor1之间,ghjaz1
δnt
蛋白序列如seq id no.73所示)、pgbkt7::ghjaz1
δzim
(seq id no.76所示ghjaz1
δzim
基因序列插入到pgbkt7质粒的bamh1和ecor1之间,ghjaz1
δzim
蛋白序列如seq id no.75所示)、pgbkt7::ghjaz1
δjas
(seq id no.78所示ghjaz1
δjas
基因序列插入到pgbkt7质粒的bamh1和ecor1之间,ghjaz1
δjas
蛋白序列如seq id no.77所示)等棉花jaz酵母质粒和pgadt7::ghmyc2(基因编号为gh_a12g1893(/)的dna片段插入到pgadt7质粒的bamh1和ecor1之间)、pgadt7::ghninja(基因编号为gh_d05g0252(/)的dna片段插入到pgadt7质粒的bamh1和ecor1之间)、pgadt7::ghtpl(基因编号为gh_d05g1161
(/)的dna片段插入到pgadt7质粒的bamh1和ecor1之间)、pgadt7::ghhda6(基因编号为gh_d03g0986(/)的dna片段插入到pgadt7质粒的bamh1和ecor1之间)、pgadt7::ghcoi1(基因编号为gh_a05g2749(/)的dna片段插入到pgadt7质粒的bamh1和ecor1之间)等载体质粒,然后经测序验证正确后分别共转(一个是pgbkt7+基因质粒,一个是pgadt7+基因质粒)酵母感受态y2hgold(上海唯地公司,货号:yc1002),分别加入carrier dna(95℃,5min)、peg/liac并混匀,30℃水浴30min(15min时翻转6-8次混匀),42℃水浴15min(7.5min时翻转6-8次混匀),5000rpm离心40s,弃上清,加入ddh2o重悬,5000rpm离心30s,弃上清,加入ddh2o重悬,涂于二缺培养基(sd/-leu/-trp),28℃培养1-2天,长斑后,挑斑点在四缺培养基中(sd-ade/-his/-leu/-trp,添加aba、x-α-gal),28℃培养3-4天后观察互作情况。
[0139]
荧光素酶实验验方法:将ghjaz1(对应的编码基因序列如seq id no.39所示)亚克隆到pcambia-nluc载体(chen,h.,et al."firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants."plant physiology 146.2(2008):368-376.)的kpni和sali酶切位点之间,ghmyc2(基因编号为gh_a12g1893(/))、ghninja(基因编号为gh_d05g0252(/))、ghcoi1(基因编号为gh_a05g2749(/))等转录因子分别亚克隆到pcambia-nluc(chen,h.,et al."firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants."plant physiology 146.2(2008):368-376.)的kpni和sali酶切位点之间,然后将构建好的质粒转化农杆菌gv3101(psoup-p19)(上海唯地生物技术有限公司,货号:ac1003),冰上5min,液氮5min,37℃水浴5min,冰上5min,加入lb液体培养基,28℃,220rpm,2-3h后涂布于相应抗生素(卡那霉素+利福平)的lb固体平板上,于28℃培养2-3天。长斑后挑取阳性单克隆进行培养,然后相应的nluc和cluc载体进行混合并注射烟草的叶片(黑暗1天/光照1天),然后拍照前在侵染叶片处涂抹荧光素酶底物,放在暗室里至少6min以猝灭荧光,随后在nightowl-ii lb983仪器,点击indigobasic软件,进入设置luciferase-5min条件下观察。
[0140]
coip实验方法步骤:将非变性裂解液添加至293t细胞(普诺赛,货号:cl-0005)培养板,4℃下完全裂解细胞。将裂解物以12,000rpm离心10分钟,收集上清液。将相应的抗体添加到得到的非变性蛋白溶液中,将其在4℃下孵育过夜。用裂解缓冲液洗涤pierce tm蛋白a/g琼脂糖珠(thermo fisher scientific,inc.),将预处理过的珠子加入到细胞裂解物中,并在室温下孵育2小时。将混合液在4℃下以2500rpm离心5分钟,除去上清液,并用1ml裂解缓冲液洗涤琼脂糖珠5次。在沉淀物中加入适量蛋白质上样缓冲液,并将样品在100℃水浴10分钟,蛋白质印迹法(western blot)检测目的条带。
[0141]
酵母双杂结果显示ghjaz1与ghmyc2互作较强,ghjaz9与ghmyc2互作较弱(图5中a)。荧光素酶实验结果显示,ghjaz1与ghmyc2农杆菌混合注射烟草,在涂抹荧光素酶底物后可以观测到较强的荧光,而对照没有荧光(图5中b);ghjaz9与ghmyc2农杆菌混合注射烟草,在涂抹荧光素酶底物后可以观测到弱的荧光,而对照没有荧光(图5中c);也进一步证明ghjaz1与ghmyc2存在强相互作用,而ghjaz9与ghmyc2存在弱相互作用。
[0142]
通过酵母双杂探究ghjaz1与ja信号通路转录抑制复合物中主要蛋白的互作关系,结果显示ghjaz1与ghninja、ghtpl、ghhda6均有相互作用(图5中d),在ja-ile存在时,
ghjaz1与ghcoi1有相互作用(图5中d);荧光素酶实验结果显示ghjaz1与ghninja农杆菌混合注射烟草,在涂抹荧光素酶底物后可以观测到较亮的荧光,而对照没有荧光(图5中e);ghjaz1与ghcoi1农杆菌混合注射烟草,在涂抹荧光素酶底物后可以观测到弱的荧光,而对照没有荧光(图5中f),证明ghjaz1与ghninja、ghcoi1存在相互作用。coip结果显示ghjaz1与ghtpl、ghhda6存在相互作用(图5中g和h)。以上结果表明在棉花中jaz1与myc2、ninja、tpl等形成转录抑制复合体进而抑制myc2的转录活性。
[0143]
探究互作功能结构域对于开发功能多肽至关重要,通过酵母双杂研究缺失ghjaz1功能结构域后与ghmyc2、ghninja、ghtpl、ghhda6、ghcoi1的互作关系。结果显示ghjaz1缺失nt、zim结构域与ghmyc2的互作明显减弱,ghjaz1缺失zim结构域与ghninja的互作明显减弱,ghjaz1缺失nt、jas结构域与ghtpl的互作明显减弱,ghjaz1缺失nt结构域与ghhda6的互作明显减弱,ghjaz1缺失nt、zim、jas结构域与ghcoi1的互作均明显减弱,证明ghjaz1的nt主要参与ghmyc2、ghtpl、ghhda6、ghcoi1的互作,zim结构域参与ghmyc2、ghninja、ghcoi1互作,jas结构域与ghtpl、ghcoi1互作(图5中d)。
[0144]
实施例4、棉花jaz蛋白的抗肿瘤效果分析
[0145]
1、植物“肿瘤”与动物肿瘤的异同分析
[0146]
植物愈伤组织(植物肿瘤)与人类肿瘤存在许多相似点,如形态相似;受内源和外源刺激诱导产生;具有持久的再生和自我复制能力;细胞分裂较快、自我增值迅速、细胞生长不稳定;都受转录因子myc的调控等。“植物肿瘤”的生长被ja信号严格调控而不能恶性发展,而与具有可控性的“植物肿瘤”不同的是,人类肿瘤往往会因为不可控性而恶化发展为癌症。植物愈伤组织细胞具有全能性,可以分化成多种多样的其他组织细胞;而癌细胞分化形成的细胞还是癌细胞,还具有接触抑制现象丧失、癌细胞间粘着性减弱、粘壁性下降的特点(图6中a)。
[0147]
2、棉花jaz蛋白与人myc蛋白的互作筛选和验证
[0148]
将棉花的6个jaz代表(ghjaz1、ghjaz7、ghjaz9、ghjaz10、ghjaz11、ghjaz31,相关序列具体参见实施例3)的编码基因分别构建到pgbkt7载体(优宝生物,货号:vt1638)ecori和bamhi之间,同时将myc癌基因(c-myc(ncbi登录号:nm_002467.6)、nmyc(ncbi登录号:np_005369.2)和lmyc(ncbi登录号:np_001028254.2)分别构建到pgadt7载体(优宝生物,vt1639)ecori和bamhi之间,进行酵母双杂互作分析(方法同实施例3)。结果显示:ghjaz1同时与c-myc和nmyc发生互作(图6中b)。
[0149]
同时通过gst pull down实验验证互作。首先构建pet-30a-ghjaz1(将seq id no.39所示dna序列插入到pet-30a(+)载体(优宝生物,货号:vt1212)的ndei和hindiii之间)和pgex-4t-1-c-myc载体(将c-myc(ncbi登录号:nm_002467.6)的cds序列插入到pgex-4t-1载体(优宝生物,货号:vt1253)的bamhi和ecori之间)转化大肠杆菌bl21,冰上30min,42℃热激60s,冰上2min,加入lb培养基,37℃,200rpm,1h,涂到相应抗生素的lb平板上,37℃培养。长斑后挑取单克隆摇菌,然后扩大培养,直到培养基开始稍微变白后,加入不同浓度的iptg进行诱导,并设置不同的温度过夜培养。然后5000rpm,4℃,离心10min,等体积pbs重悬(加入pmsf、dtt)。将其超声波破碎,破碎5s,冰上5s,直至重悬液有明显变清。离心13000rpm,4℃,10min,分离上清和包涵体。将上清转入蛋白纯化柱,进行孵育后洗涤并洗脱,利用蛋白预染液逐滴进行检测并收集蛋白。经上述表达纯化得到gst-c-myc融合蛋白和
his-ghjaz1融合蛋白后,清洗gst beads,加入gst-c-myc融合蛋白2μg孵育2h;再进行清洗,加入his-ghjaz1融合蛋白1μg,并吸出部分作为input,并孵育1h;最后进行清洗,再加入loading buffer跑wb检测结果。结果也证明ghjaz1与c-myc有相互作用(图6中c)。
[0150]
利用免疫共沉淀方法(实验方法同实施例3)。coip结果显示ghjaz1与c-myc和nmyc在hek293细胞内有相互作用(图6中d和e)。
[0151]
利用luc实验方法,将c-myc(ncbi登录号:nm_002467.6)亚克隆到pcambia-nluc载体(chen,h.,et al."firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants."plant physiology 146.2(2008):368-376.)的kpni和sali酶切位点之间,并将ghjaz1(seq id no.39)亚克隆到pcambia-cluc载体(chen,h.,et al."firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants."plant physiology 146.2(2008):368-376.)的kpni和sali酶切位点之间,将构建好经测序验证阳性的重组质粒转化农杆菌gv3101(psoup-p19)(上海唯地生物技术有限公司,货号:ac1003),通过共转烟草的叶片,在注射2-3天后,在拍照前将抹上荧光素底物的侵染叶片放在机器暗室里至少6min以猝灭荧光,随后在nightowl-ii lb983仪器,点击indigobasic软件,进入设置luciferase-5min条件下观察。共侵染后培养,若有互作,就会表达luc荧光素酶,抹上底物之后即可检测到发光。如图6中f所示,ghjaz1与c-myc有相互作用。
[0152]
通过双分子荧光互补实验,将ghjaz1(seq id no.39)亚克隆到puc-spyne载体(song,yun,et al."bin2 negatively regulates plant defense against verticillium dahliae in arabidopsis and cotton."plant biotechnology journal(2021))的bamhi和xbai酶切位点之间,构建得到puc-spyne-ghjaz1。将c-myc(ncbi登录号:nm_002467.6)亚克隆到puc-spyce载体(song,yun,et al."bin2 negatively regulates plant defense against verticillium dahliae in arabidopsis and cotton."plant biotechnology journal(2021))的bamhi和xbai酶切之间,构建得到puc-spyce-c-myc。将puc-spyne-ghjaz1和puc-spyce-c-myc共同转化农杆菌gv3101瞬时浸染烟草叶片组织,激光共聚焦显微镜下观察yfp信号,如图6中g所示,ghjaz1和c-myc在烟草细胞核中有相互作用。
[0153]
3、ghjaz1蛋白对肿瘤细胞抑制效果测试
[0154]
cck8细胞活性检测:在96孔板中接种浓度为5
×
104个/ml的细胞悬液(100μl/孔)。将培养板放在培养箱中预培养(37℃,5%co2),接种细胞24h后向每孔加入对照和蛋白药剂,培养板在培养箱内24h后每孔加入10μl cck8溶液,将培养板在培养箱内孵育0.5~2小时,用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0155]
ghjaz1与原癌基因c-myc和nmyc有较强的相互作用,我们构建了带有his标签的ghjaz1原核表达质粒表达蛋白(参见实施例4步骤2)后通过wb检测发现ghjaz1蛋白加6个his大小约30kd(图7中a)。用纯化得到的ghjaz1蛋白处理乳腺癌细胞(mcf7)和乳腺上皮细胞(mcf10a),并用cck8测定细胞活力,结果显示随着ghjaz1蛋白浓度加大,mcf7细胞活力显著降低(图7中b),mcf10a细胞活力没有显著变化(图7中c)。
[0156]
细胞凋亡染方法。荧光显微镜检测:a.接种培养。将细胞接种于96孔板等多孔板、细胞培养皿中或者细胞爬片上,按实验设计对细胞进行一定处理。b.洗涤(选做)。对于贴壁细胞,吸除培养液,用pbs洗涤细胞1遍;对于悬浮细胞,250-1000
×
g室温离心5min,吸
除上清,用pbs洗涤1遍。酚红或血清对于本试剂盒的检测有一定的干扰,吸除培养液和pbs时最好使用真空泵。在能充分吸净残留液体的情况下,可以不使用pbs洗涤。c.染。加入适当体积的calcein am/pi检测工作液(碧云天生物技术,calcein/pi细胞活性与细胞毒性检测试剂盒,货号:c2015)。通常96孔板每孔加入100μl,24孔板每孔加入250μl,12孔板每孔加入500μl,6孔板每孔加入1ml。37℃避光孵育30min。不同的细胞最佳孵育时间有所不同,以30min作为初始孵育时间,后续可以根据实际染效果对染时间进行适当调整和优化,以得到更加理想的染效果。d.检测。孵育结束后,在荧光显微镜下观察染效果(calcein am为绿荧光,ex/em=494/517nm;pi为红荧光,ex/em=535/617nm)。注意整个过程均需注意避光操作。
[0157]
对细胞进行凋亡染,结果显示ghjaz1蛋白处理后mcf7细胞死亡率显著升高(图7中d-k)。我们进一步用ghjaz1蛋白处理肺癌细胞a549、卵巢癌细胞skov3、宫颈癌细胞hela,结果发现这些癌细胞均能被ghjaz1蛋白抑制(图7中l-n)。这些实验结果表明ghjaz1蛋白可以高效广谱抑制癌细胞。
[0158]
4、ghjaz1蛋白对肿瘤细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响分析
[0159]
为了进一步探究ghjaz1蛋白对肿瘤细胞抑制的分子机理,对ghjaz1(使用ic50浓度,即0.691μm)蛋白处理过的mcf7乳腺癌细胞和正常细胞乳腺上皮细胞mcf10a,24h后进行凋亡和细胞周期检测。
[0160]
细胞凋亡检测:收集细胞于1.5ep管中,300g离心5min,弃上清,收集细胞,pbs洗涤并重悬。取1
×
105重悬的细胞,300g离心5min,弃上清。pbs洗涤,加入500μl稀释的1
×
annexin v binding buffer工作液重悬细胞,加入5μl的annexin v-fitc和5μl的碘化丙啶(pi)染液,涡旋混匀后室温避光孵育15-20min,上机检测。具体采用annexin v-fitc/pi荧光双染细胞凋亡检测试剂盒(武汉普诺赛生命科技有限公司,货号:p-ca-201)。
[0161]
细胞周期检测:胰酶适度消化细胞,离心收集细胞,去除上清,pbs清洗细胞,1500rpm,5min离心收集,制备单细胞悬液(浓度:1
×
106/ml)。然后取1ml单细胞悬液离心,弃上清,加入70%预冷乙醇500μl固定细胞,4℃固定过夜。次日,离心收集细胞,1ml pbs重悬并离心,细胞沉淀中加入100μl rnase a溶液重悬,37℃水浴30min,加入400μl pi染液混匀,4℃避光孵育30min,上机检测,记录激发波长488nm处红荧光。具体采用dna含量检测试剂盒(细胞周期)(索莱宝,货号:ca1510)。
[0162]
细胞凋亡检测结果显示ghjaz1导致癌细胞的凋亡率升高(图8中a-c),而对正常细胞无显著影响(图8中d-f)。细胞周期检测结果显示,ghjaz1处理会导致癌细胞s期细胞比例降低、g2-m期细胞比例升高、细胞周期阻滞在g2-m期(图8中g-i),而mcf10a细胞则没有出现g2-m期阻滞现象(图8中j-l)。
[0163]
5、ghjaz1对c-myc下游基因的调控
[0164]
为了进一步探究ghjaz1抑制癌细胞增殖的机理,我们对ghjaz1蛋白(使用ic50浓度,即0.691μm)处理过的mcf7细胞24h后进行转录组测序,结果显示细胞周期相关基因的表达下调(图9中a),rt-pcr(方法步骤同实施例1)验证与转录组结果一致(图9中b)。其中,rt-pcr引物序列如下:
[0165]
内参基因aactin,检测引物为:
[0166]
human-actin-f:5-catgtacgttgctatccaggc-3;
[0167]
human-actin-r:5-ctccttaatgtcacgcacgat-3。
[0168]
用于检测dhfr的引物为:
[0169]
q-dhfr-f:5-atggttggttcgctaaactgcatc-3;
[0170]
q-dhfr-r:5-ccttgagttctctgctgagaactaaattaa-3。
[0171]
用于检测cdc45的引物为:
[0172]
q-cdc45-f:5-ctttgactacgagcagtatgaatatcatg-3;
[0173]
q-cdc45-r:5-tgtgcagtccacggagagtgtg-3。
[0174]
用于检测cdca7的引物为:
[0175]
q-cdca7-f:5-ctgatgacagttgtgacagctttgc-3;
[0176]
q-cdca7-r:5-gaatcggagttggaatcagtcaca-3。
[0177]
用于检测cdc16的引物为:
[0178]
q-cdc16-f:5-attgtatgaagcatgtcgttaccttgc-3;
[0179]
q-cdc16-r:5-tgtaggtagccagggttcggttat-3。
[0180]
用于检测pold1的引物为:
[0181]
q-pold1-f:5-aggatgcctacctgccactg-3;
[0182]
q-pold1-r:5-ggtacagcgaggagaagtccagg-3。
[0183]
用于检测polk的引物为:
[0184]
q-polk-f:5-agacaagctgtgatggacttcatcaa-3;
[0185]
q-polk-r:5-ctcttccgctttatttatctcactgaatg-3。
[0186]
根据文献报道的c-myc下游基因,进一步通过rt-pcr进行验证,结果显示癌细胞mcf7中,ghjaz1处理后,c-myc下游的凋亡相关基因bcl2、bax、hk2、fasn、mcm5极显著下调,p21基因极显著上调;细胞周期相关基因ccna2、ccnb1、ccnd1极显著下调,ccne1极显著上调(图9中c)。而在正常细胞mcf10a中只有bcl2、mcm5显著下降,但下降幅度较低,p21c、cnb1、ccnd1 ccne1均显著上升,但是上升幅度也较小,整体无明显趋势(图9中d)。其中,引物序列为:
[0187]
内参基因aactin,检测引物为:
[0188]
human-actin-f:5-catgtacgttgctatccaggc-3;
[0189]
human-actin-r:5-ctccttaatgtcacgcacgat-3。
[0190]
用于检测c-myc的引物为:
[0191]
q-c-myc-f:5-atggtgaccgagctgctggg-3;
[0192]
q-c-myc-r:5-ccaccgaggggtcgatgca-3。
[0193]
用于检测p21的引物为:
[0194]
q-p21-f:5-gatgtccgtcagaacccatgcg-3;
[0195]
q-p21-r:5-cgctcccaggcgaagtcacc-3。
[0196]
用于检测bcl2的引物为:
[0197]
q-bcl2-f:5-gggtacgataaccgggagatagtgatg-3;
[0198]
q-bcl2-r:5-gcaccgggctgagcgcag-3。
[0199]
用于检测bax的引物为:
[0200]
q-bax-f:5-gaggcacccgagctggcc-3;
[0201]
q-bax-r:5-tgatcagttccggcaccttggt-3。
[0202]
用于检测hk2的引物为:
[0203]
q-hk2-f:5-cgctgtggtggacaggatacgag-3;
[0204]
q-hk2-r:5-ctatcgctgtccagcctcacgga-3。
[0205]
用于检测fasn的引物为:
[0206]
q-fasn-f:5-ggaagctgccagagtcggagaactt-3;
[0207]
q-fasn-r:5-gtccacgatggcttcataggtgactt-3。
[0208]
用于检测mcm5的引物为:
[0209]
q-mcm5-f:5-atgtcgggattcgacgatcctg-3;
[0210]
q-mcm5-r:5-tgtaatgccgcttgagttcatccc-3。
[0211]
用于检测ccna2的引物为:
[0212]
q-ccna2-f:5-ctatcctcgtggactggttagttg-3;
[0213]
q-ccna2-r:5-aactttgaggctaacagcatagca-3。
[0214]
用于检测ccnb1的引物为:
[0215]
q-ccnb1-f:5-gaaattcaggttgttgcaggagac-3;
[0216]
q-ccnb1-r:5-gtgcttagtataagtgttgtcagtcacaaa-3。
[0217]
用于检测ccnd1的引物为:
[0218]
q-ccnd1-f:5-agctcctgtgctgcgaagtgga-3;
[0219]
q-ccnd1-r:5-gacaggaagcggtccaggtagttca-3。
[0220]
用于检测ccne1的引物为:
[0221]
q-ccne1-f:5-tttacccaaactcaacgtgcaag-3;
[0222]
q-ccne1-r:5-tagacttcacacacctccattaacca-3。
[0223]
实施例5、ghjaz1蛋白进入癌细胞和细胞核分析
[0224]
1、ghjaz1与肿瘤细胞表面受体蛋白互作筛选与验证
[0225]
为了探究ghjaz1如何进入癌细胞,我们克隆了大多数肿瘤表面受体基因,包括upar(ncbi数据库登录号nm_002659.4)、cck1r(np_000721.1)、cck2r(np_001350481.1)、her2(np_004439.2)、grpr(np_005305.1)、muc1(np_001358649.1)、vegfr1(np_002010.2)、insulin receptor(nm_000208.4)、ntr(xm_011528827.2)、psma(xm_017017432.1)、tfr1(nm_001128148.3)、tfr2(nm_003227.4)、pept1(nm_005073.4)、apn(nm_001150.3)。然后通过酵母双杂(实验步骤同实施例3)筛选与ghjaz1互作的受体蛋白。结果显示ghjaz1与upar有相互作用(图10中a)。进一步进行coip实验(方法步骤同实施例3),结果显示ghjaz1与upar在体内有相互作用(图10中b)。upa为upar的配体,我们通过酵母双杂(实验步骤同实施例3)检测ghjaz1与upa(ncbi数据库登录号np_002649.2)和upar的相互作用。结果显示ghjaz1与upa的atf结构域有相互作用,upa的atf结构域和upar也有相互作用(图10中c和d)。
[0226]
2、ghjaz1蛋白的入核检测
[0227]
ghjaz1通过癌细胞表面受体upar进入细胞,那它是否可以入核呢?我们进一步设计并构建原核表达载体,将ghjaz1+rfp(氨基酸序列见seq id no.71,对应的编码基因序列如seq id no.72)连接到pet-30a(+)载体(优宝生物,货号:vt1212)的ndei和hindiii之间,
原核表达纯化带有红荧光的ghjaz1+rfp蛋白(方法步骤同实施例4步骤2)(图11中a),然后用ghjaz1+rfp蛋白处理mcf7细胞,荧光显微镜下观察。结果显示红荧光下对照无光(图11中b-e),加有ipr803(upar抑制剂,浓度为50μm)(medchemexpress公司,货号:hy-111192)在细胞核外有红荧光(图11中f-i),加ghjaz1+rfp蛋白(浓度为0.5μm)的荧光呈点状分布,并且和细胞核的蓝荧光有重合(图11中j-m),证明ghjaz1进入细胞核内。
[0228]
实施例6、ghjaz1对卵巢癌小鼠模型的体内抗肿瘤效果分析
[0229]
培养人卵巢癌细胞skov3。荷瘤前使用胰酶消化细胞,pbs洗涤2次后将细胞用pbs重悬至1
×
108个/ml的浓度。将细胞悬液注射入裸鼠腋下皮下,每只裸鼠的接种量为0.2ml。接种后将裸鼠随机分为2组,分别为pbs组、ghjaz1蛋白(5mg/kg)处理组,每组8只。肿瘤接种后待肿瘤体积达到50~100mm3左右开始给药,每2天瘤内注射给药1次,每次给药前测量肿瘤的长和宽,给药周期14天,7次。在整个实验过程中,给药的同时监测裸鼠体重,采用游标卡尺测量肿瘤大小,运用公式v=1/2
×

×

×
宽,计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。14天后,取出肿瘤拍照、称重。
[0230]
瘤内注射结果显示,随着注射天数的延迟,注射ghjaz1蛋白组小鼠肿瘤的体积极显著低于对照组(图12中b),图12中a和c显示的为注射14天后小鼠及取出的肿瘤,注射组肿瘤的重量极显著低于对照组(图12中d)。
[0231]
实施例7、酵母双杂解析ghjaz1与upar、c-myc互作结构域
[0232]
采用上海唯地公司的酵母双杂交感受态y2hgold,构建pgbkt7::ghjaz1、pgbkt7::ghjaz1
δnt
、pgbkt7::ghjaz1
δzim
、pgbkt7::ghjaz1
δjas
等棉花jaz酵母质粒(参见实施例3)和pgadt7::upar(upar的ncbi数据库登录号nm_002659.4)、pgadt7::upar-d1d2(upar-d1d2的编码基因序列如seq id no.80,对应氨基酸序列如seq id no.79)、pgadt7::upar-d1hd3(upar-d1hd3的编码基因序列如seq id no.82,对应氨基酸序列如seq id no.81)、pgadt7::upar-d2d3(upar-d2d3的编码基因序列如seq id no.84,对应氨基酸序列如seq id no.83)、pgadt7::c-myc(c-myc的ncbi登录号:nm_002467.6)、pgadt7::nmyc(nmyc的ncbi登录号:np_005369.2)、pgadt7::c-myc-150aa(c-myc-150aa的编码基因序列如seq id no.86,对应氨基酸序列如seq id no.85)、pgadt7::c-myc-215aa(c-myc-215aa的编码基因序列如seq id no.88,对应氨基酸序列如seq id no.87)等载体质粒(将以上基因的cds亚克隆到pgadt7(优宝生物,vt1639)或pgbkt7(优宝生物,vt16398)的ecori和bamhi酶切位点之间)分别共转酵母感受态,然后按照感受态说明书实施实验(方法步骤同实施例3),检测棉花ghjaz1与upar、c-myc互作结构域。
[0233]
酵母双杂交结果显示ghjaz1缺失nt结构域与upar的互作明显减弱(图13中a);upar缺失d3结构域与ghjaz1的互作明显减弱为无(图13中b),说明ghjaz1的nt结构域与upar的d3结构域参与互作。ghjaz1缺失nt结构域与c-myc的互作明显减弱(图13中c);c-myc截短前150个氨基酸和前215氨基酸与ghjaz1均有强互作(图13中d和e),说明ghjaz1的nt结构域与c-myc的n端互作。
[0234]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申
请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。

技术特征:


1.a)或b)或c)或d)在如下p1-p4任一中的应用:a)、植物jaz蛋白;b)、所述植物jaz蛋白的衍生多肽;c)、a)中所述植物jaz蛋白或b)中所述衍生多肽的修饰产物;d)、a)中所述植物jaz蛋白或b)中所述衍生多肽的相关生物材料;所述相关生物材料为如下任一:1)编码所述植物jaz蛋白或所述衍生多肽的核酸分子;2)含有所述核酸分子的表达盒、表达载体或重组微生物;p1、制备用于和/或预防人或动物肿瘤的产品;p2、制备用于抑制人或动物肿瘤的发生和/或发展的产品;p3、制备用于抑制人或动物肿瘤细胞增殖的产品;p4、制备用于促进人或动物肿瘤细胞凋亡的产品。2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述植物jaz蛋白能够与人或动物的myc蛋白互作;进一步地,所述myc蛋白为c-myc蛋白nmyc和/或lmyc蛋白;和/或所述植物jaz蛋白具有如下功能中的全部或部分:将人或动物肿瘤细胞的细胞周期阻滞在g2-m期;调控人或动物肿瘤细胞中c-myc下游基因;与癌细胞表面受体upar互作;与癌细胞表面受体upar的配体upa互作;进入人或动物肿瘤细胞的细胞核;进一步地,所述调控c-myc下游基因体现为如下中的全部或部分:c-myc下游的凋亡相关基因bcl2、bax、hk2、fasn、mcm5下调,p21基因上调;细胞周期相关基因ccna2、ccnb1、ccnd1下调,ccne1上调。3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:所述植物jaz蛋白为来源于棉花的jaz蛋白;进一步地,所述来源于棉花的jaz蛋白为如下任一:(a1)氨基酸序列如seq id no.1至seq id no.35中任一所示的蛋白质;(a2)将(a1)中所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且来源于棉花具有相同功能的蛋白质;(a3)与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上或者80%以上同一性且来源于棉花具有相同功能的蛋白质;(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接蛋白标签后得到的融合蛋白;或,编码所述植物jaz蛋白的核酸分子为如下任一:(b1)seq id no.36至seq id no.70中任一所示的dna分子;(b2)在严格条件下与(b1)限定的dna分子杂交且编码所述来源于棉花的jaz蛋白的dna分子;(b3)与(b1)-(b2)中任一限定的dna序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上或者80%以上同源性且编码所述来源于棉花的jaz蛋白的dna分子。4.根据权利要求1-3中任一所述的应用,其特征在于:所述人或动物肿瘤选自如下:卵
巢癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌;所述人或动物肿瘤细胞选自如下:卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞;进一步地,所述卵巢癌细胞为skov3细胞;所述乳腺癌细胞为mcf7细胞;所述宫颈癌细胞为hela细胞;所述肺癌细胞为a549细胞。5.根据权利要求1-4中任一所述的应用,其特征在于:所述产品为药物。进一步地,所述药物为在所述a)或所述b)或所述c)的基础上,加入药学上可接受的辅料制备而成的;更进一步地,所述药品为片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、注射针剂或口服液。6.权利要求1-3任一中所述a)或所述b)或所述c)或所述d)在抑制植物愈伤组织生长中的应用;进一步地,所述植物愈伤组织为棉花愈伤组织。7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:所述植物jaz蛋白具有如下功能中的全部或部分:在植物体内,与ninja蛋白、tpl蛋白、hda6蛋白均有相互作用;在ja-ile存在时,与coi1蛋白有相互作用;能够与myc2蛋白、ninja蛋白、tpl蛋白形成复合体。8.ja合成抑制剂在抑制植物愈伤组织生长中的应用;进一步地,所述ja合成抑制剂为铜试剂dicea或布洛芬;和/或进一步地,所述植物愈伤组织为棉花愈伤组织。9.一种抑制植物愈伤组织生长的方法,是以权利要求1-3任一中所述a)或所述b)或所述c)或所述d)或权利要求8中所述ja合成抑制剂抑制植物愈伤组织生长;进一步地,所述植物愈伤组织为棉花愈伤组织。10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于:所述方法包括如下步骤:实验组:在目的植物中过表达权利要求1-3任一中所述植物jaz蛋白或所述衍生多肽,得到转基因阳性植株;从所述转基因阳性植株上取外植体进行组培,得到愈伤组织;对照组:与所述实验组的差别仅在于进行组培时所取的外植体来自于未转基因的所述目的植物;所述实验组的愈伤组织生长速度慢于所述对照组;或所述方法包括如下步骤:实验组:从目的植物上取外植体置于添加有所述ja合成抑制剂的愈伤组织诱导培养基上进行组培,得到愈伤组织;对照组:与所述实验组的差别仅在于进行组培时采用的愈伤组织诱导培养基中不含有所述ja合成抑制剂;所述实验组的愈伤组织生长速度慢于所述对照组;进一步地;所述ja合成抑制剂为dicea或布洛芬。

技术总结


本发明公开了植物JAZ蛋白及衍生多肽在预防和人与动物肿瘤中的应用。本发明提供了植物JAZ蛋白或其衍生多肽或其修饰产物或其相关生物材料在制备用于和/或预防人或动物肿瘤、抑制人或动物肿瘤的发生发展、抑制人或动物肿瘤细胞增殖、促进人或动物肿瘤细胞凋亡的产品中的应用。棉花JAZ蛋白对多种人源肿瘤细胞系均有显著抑制作用,对小鼠活体肿瘤的发生发展有显著抑制作用,JAZ蛋白与人源原癌基因MYCs存在强互作。JAZ蛋白可靶向多种类型的人和动物肿瘤,能够开发成为人和动物肿瘤靶向药物。本发明为多种人和动物肿瘤提供新型的药物或辅助药物。的药物或辅助药物。


技术研发人员:

李付广 任茂智 邢亚迪

受保护的技术使用者:

农业科学院棉花研究所

技术研发日:

2021.06.16

技术公布日:

2022/12/15

本文发布于:2022-12-23 18:30:32,感谢您对本站的认可!

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