直接多肽反应试验在化妆品检测中的应用

直接多肽反应试验化妆品检测中的应用
丁诗璇;李小林;曲栗;邱璐
【摘 要】以OECD指南为基础,在实验室建立直接多肽反应试验(DPRA)方法并进行实验室内验证,同时评估该方法对测试化妆品配方致敏反应的可能性.依据OECD TG 442C指南,将受试物(包括化学品和化妆水配方)分别与半胱氨酸多肽和赖氨酸多肽以10∶1和50∶1的比例避光孵育24 h,采用高效液相谱法分析两种多肽的消耗,计算多肽消耗率并依据DPRA预测模型对受试物致敏性进行判定.由试验结果可知,DPRA可准确区分16种化学品的致敏性,检测结果与OECD TG442C指南及文献中小鼠淋巴结试验(LLNA)结果一致;DPRA对3种化妆水配方检测结果分别为致敏物、致敏物、非致敏物,与多肽反应程度分别为中、低和无.
【期刊名称】zyzq《日用化学品科学》
【年(卷),期】2018(041)011
【总页数】豆渣搅拌机6页(P19-24)
【关键词】化妆品;直接多肽反应试验;皮肤致敏;替代方法
防水摄像头【作 者】丁诗璇;李小林;曲栗;邱璐
【作者单位】上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心,上海200135;上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心,上海200135;上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心,上海200135;上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心,上海200135
牵引头【正文语种】中 文
【中图分类】TQ658
过敏性接触性皮炎是皮肤对外源物质产生的免疫原性皮肤反应,主要的反应特征为瘙痒、红斑、丘疹等,因此皮肤过敏性评价是化学品分类标识、化妆品毒理学评价的重要内容[1]。传统的皮肤致敏试验包括豚鼠局部封闭涂皮试验和最大值试验,2002年小鼠淋巴结试验(local lymph node assay,LLNA)被OECD采纳作为皮肤致敏试验的替代方法,它采用细胞学指标观察小鼠局部暴露后淋巴细胞增殖情况,减少了实验动物数量[2]。
近年来,在评估毒性作用的模式框架中提出了有害结局通路(adverse outcome pathway,
AOP)的概念,2007年“21世纪毒性测试:愿景与策略(Toxicity Testing in the 21st Century,TT21C)”的发表推动了AOP的研究和应用。皮肤致敏的AOP通路见图1,其分子起始事件是外源物质渗入表皮层与皮肤蛋白共价结合形成半抗原复合物,随后角质形成细胞激活发生炎性反应,同时被激活的树突状细胞迁移至局部淋巴结,将半抗原复合物呈递至T淋巴细胞,最终导致T细胞的增殖和分化。当皮肤再次接触相同过敏原时进入激发阶段,触发炎性反应[3]。目前,基于AOP关键事件开发的替代方法有直接多肽反应试验(direct peptide reactivity assay,DPRA)[4]、角质细胞ARE-Nrf2荧光素酶检测方法[5]和人细胞系活化试验(human cell line activation test,h-CLAT)[6]。
图1 皮肤致敏的有害结局通路(AOP)Fig.1 Adverse outcome pathway(AOP)of skin sensitization
DPRA方法是针对皮肤致敏AOP起始事件建立的体外替代方法,2015年被收录至OECD TG 442C指南。DPRA的检测结果与LLNA数据一致性达到89%,不同实验室间再现性良好[4],但目前DPRA只用于对单一化学品和化妆品原料进行检测,对化妆品产品的检测未见报道,而我国化妆品法规标准要求针对化妆品产品进行检测。本研究旨在转化和建立DPR
A方法,并进行实验室内部验证,在此基础上采用DPRA对化妆品配方进行致敏性检测,为DPRA在化妆品产品检测中的应用提供依据。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
人工合成半胱氨酸多肽(Ac-RFAACAA-COOH,分子量751.9,纯度95%)和赖氨酸多肽(Ac-RFAAKAA-COOHA,分子量776.2,纯度95%),苏州强耀生物有限公司;乙腈(谱纯),三氟乙酸(TFA)、二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠、乙酸铵、氨水(分析纯),Sigma公司。实验室流化床
受试样品:恶唑酮、2,4-二硝基氯苯(2,4-Dinitrochlorobenzene,DNCB)、对苯醌、甲氨基酚硫酸盐、乙二醛、肉桂醛、苯亚甲基丙酮、2,3-丁二酮、甲醛、金合欢醛、丁香油酚、1-丁醇、6-甲基香豆素、4-甲氧基苯乙酮、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘油,均为分析纯, Sigma公司;化妆水,自制(配方成分见1.2.6)。
高效液相谱仪 Agilent 1260,谱柱Waters C18(5 μm,4.6 mm ×150 mm)。
1.2 实验方法
1.2.1 溶液配制
pH为7.5的100 mmol·L-1磷酸盐缓冲液:将18 mL 0.1 mmol·L-1磷酸二氢钠溶液与82 mL 0.1 mmol·L-1磷酸氢二钠溶液混合,调节pH至7.5。
配制pH为10.2的100 mmol·L-1乙酸铵缓冲液;配制高效液相谱流动相A:1 mL三氟乙酸加入至1 L谱纯水中;配制高效液相谱流动相B:850 μL三氟乙酸加入至1 L谱纯乙腈中。
1.2.2 受试物前处理
受试样品均配制成摩尔浓度为100 mmol·L-1溶液,体积3 mL。溶剂首选乙腈,若不溶解,可尝试溶解于水、水/乙腈(1∶1)、异丙醇、丙酮、丙酮/乙腈(1∶1),也可溶解于300 μL二甲基亚砜后用2 700 μL乙腈稀释,或用1 500 μL二甲基亚砜溶解后用1 500 μL乙腈稀释。
旋转装置采用乙腈为溶剂分别配制100,50,10和1 mmol·L-1 2,4-二硝基氯苯溶液(典型皮肤致敏阳性参照物)用于后续DPRA对2,4-二硝基氯苯剂量-反应关系评价。
1.2.3 多肽处理
0.667 mmol·L-1半胱氨酸多肽溶液:称取12.5 mg半胱氨酸多肽溶解于25 mL磷酸盐缓冲液中。
0.667 mmol·L-1赖氨酸多肽溶液:称取12.9 mg赖氨酸多肽溶解于25 mL乙酸铵缓冲液中。
1.2.4 标准溶液配制
将8 mL磷酸盐缓冲液和8 mL乙酸铵缓冲液分别与2 mL乙腈混合配制成稀释缓冲液。取1 600 μL 0.667 mmol·L-1多肽溶液加入到400 μL乙腈中配制成标准母液。将标准母液与稀释缓冲液等比例稀释混合配制摩尔浓度分别为0.534,0.267,0.133 5,0.066 7,0.033 4,0.016 7和0 mmol·L-1的标准曲线溶液。
1.2.5 空白对照、共洗脱对照、样品制备
取1 mL进样瓶,半胱氨酸多肽及赖氨酸多肽分别与受试物以1∶10(0.5 mmol·L-1多肽,5 mmol·L-1受试物)及1∶50(0.5 mmol·L-1多肽,25 mmol·L-1受试物)比例混合,按表1
加入试剂,混匀,每个样品、对照均平行制备3份。进样瓶置室温下避光孵育24 h后分别用高效液相谱进行检测。
表1 空白对照、共洗脱对照及样品配制表Tab.1 Preparation of reference controls,co-elution controls and samples半胱氨酸多肽溶液/μL赖氨酸多肽溶液/μL pH7.5磷酸盐缓冲液/μL pH10.2乙酸铵缓冲液/μL乙腈/μL受试物溶液/μL 溶剂/μL半胱氨酸多肽 750 — — — 200 — 50赖氨酸多肽 — 750 — — — — 250共洗脱对照 半胱氨酸多肽 — — 750 — 200 50 —赖氨酸多肽 — — — 750 — 250 —样品 1∶10 半胱氨酸多肽 750 — — — 200 50 —1∶50 赖氨酸多肽 — 750 — — — 250 —空白对照
1.2.6 化妆水乙腈溶液配制
3种自制化妆水配方组成见表2。依据化妆水组分(除水外)计算平均相对分子量,配制100 mmol·L-1化妆水乙腈溶液进行DPRA实验。
表2 化妆水配方成分Tab.2 Ingredients of toners组分 w/%配方1 配方2 配方3水19.9 59.9 69.7酒精 20 20 20甘油 10 10 10吐温-80 0.1 0.1 0.1肉桂醛 50 10 0.2
1.2.7 谱条件
柱温25 ℃,进样量10 μL,流动相流速为1 mL/min, 梯度洗脱,于220 nm处检测多肽峰面积。HPLC洗脱条件见表3。
表3 HPLC梯度洗脱条件Tab.3 HPLC flow conditions时间/min φ(流动相B)/% φ(流动相A)/%半胱氨酸多肽 赖氨酸多肽0 0 10 90 12 8 52 48 13 8.5 90 10 15 10 90 10 16 10.5 10 90 20 12 10 90
多肽消除率计算公式为:
1.2.8 DPRA预测模型
根据DPRA预测模型[4]对受试物进行判定(见表4)。判断受试物为非致敏物的阈值为6.38%,当6.38%<消除率≤22.62%时,反应程度为低,当22.62%<消除率≤44.4%时,反应程度为中,大于42.47%时反应程度为高。当受试物与赖氨酸多肽发生共洗脱时,仅采用半胱氨酸多肽消除率进行判断,非致敏物阈值为13.89%,致敏物反应程度划分为低、中、高。
表4 DPRA预测模型Tab.4 DPRA prediction model多肽消除率/% 半胱氨酸多肽消除率/% 反应程度 DPRA预测结果消除率≤6.38 消除率≤13.89 无 阴性6.38<消除率≤22.62 13.89<消除率≤23.09低阳性22.62<消除率≤44.47 23.09<消除率≤98.24中阳性44.47<消除率≤100 98.24<消除率≤100高阳性
2 结果与讨论
当前皮肤致敏的AOP框架已基本建立,其中致敏原与蛋白质结合,也就是半抗原化,是启动皮肤敏感的关键步骤,发生在树突状细胞呈递抗原并激活T细胞引起皮肤致敏的有害结局之前[7]。大多数致敏原(或其代谢产物)为具有亲电性的小分子化合物(分子量小于500 Da),能与具有亲核试剂结合形成共价键。蛋白质中许多氨基酸侧链具有亲核性,能与致敏原结合。目前研究发现能与亲核试剂结合的氨基酸有半胱氨酸、赖氨酸、谷胱甘肽、甲硫氨酸等[8,9]。DPRA试验模拟了半抗原化这一过程,使用化学方法模拟致敏原与合成半胱氨酸多肽和赖氨酸多肽的结合,运用高效液相谱测定两种多肽的消耗情况,根据多肽消耗率来预测受试物的致敏能力[9,10]。

本文发布于:2023-06-15 20:49:10,感谢您对本站的认可!

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