液相谱-质谱法测定水产品中喹诺酮类药物

第49卷第11期2021年6月
广州化工
Guangzhou  Chemical  Industry
Vol. 49 No. 11Jun. 2021
液相谱-质谱法测定水产品中瞳诺酮类药物
朱品玲,钟茂生,翁才振,严 飞,陈舒奕,陈珍珍,苏 怡
(宁德海关,福建宁德352100)
摘 要:建立了 QuEChERS 前处理方法结合LC-MS/MS 内标法测定水产品中17种唾诺酮类药物残留同时检测的方法。样品 经含5%甲酸的乙睛提取,经EMR-Lipid  dSPE 净化,EMR  polish 脱水,浓缩定容后以电喷雾电离正离子(ESI+)、多反应检测模式 (MRM)进行检测,内标法定量。该分析方法快速、准确,在大黄鱼、鲂鱼进行0.1 fxg/kg 加标水平测试,其回收率为84. 9% ~ 111.5%, RSD 为5.29% -22.66% o 该方法适用于水产品中17种唾诺酮类药物的测定。
关键词:液相谱-串联质谱法;水产品;唾诺酮类药物残留
中图分类号:0657 文献标志码:A  文章编号:1001 -9677(2021)011 -0087-06
Determination  of  Quinolones  Residues  in  Aquatic  Products  by
Liquid  Chromatography  Mass  Spectrometry  *
*基金项目:福州海关科技计划项目(FK2017-ND001)。
第一作者:朱品玲(1979-),女,工程师,主要从事食品安全检测。
ZHU  Pin-ling, ZHONG  Mao-sheng, WENG  Cai-zhen, YAN  Fei, CHEN  Shu-yi, CHEN  Zhen-zhen, SU  Yi
(Ningde  Customs , Fujian  Ningde  352100, China)
Abstract : QuEChERS  pre t reatment  method  combined  with  LC  - MS/MS  was  established  for  the  simultaneous  determination  of  17 quinolones  residues  in  aquatic  products  using  internal  standard  method. The  sample  was  extracted  with  acetonitrile  containing  5% formic  acid, purified  by  EMR-Lipid  dSPE , dehydrated  by  EMR  polish , concentrated  and  detected  by  electrospray  ionization  positive  ion  ( ESI  +) and  multiple  reaction  detection  mode  ( MRM ) , usi
ng  internal  standards. The  method  was  rapid  and  accurate. Tests  for  recovery  were  made  by  addition  of  mix  standards  of  0. 1 p,g  • kg -1 in  yellow  croaker  and  perch. The  recoveries  were  84. 9% ~ 111. 5% with  RSD  of  5. 29% ~ 22. 66%. The  method  was  suitable  for  the  determination  of  17 quinolones  in  aquatic  products.
Key  words : liquid  chromatography  -tandem  mass  spectrometry  ( LC  -MS/MS ) ; aquatic  products  ; quinolones  residues
宁德市海岸线长1046公里,拥有世界级天然深水良港三 都澳,海域面积4. 46万平方公里,是全国最大的大黄鱼养殖 基地,产量占全国的80%。近年养殖方式逐步向集约化和规模 化发展,受自身有机污染积累、养殖生态环境恶化及区域间苗 种的频繁交流等因素影响,各种疾病频发,养殖业损失严重, 因而药物的使用变成常规手段。由于渔业的特殊性,只能通过 饲料添加、水体添加等方式让鱼类在摄食时摄入药物,药物的 剂量和药效很难控制,从而经常超量使用药物。唾诺酮类 (Quinolones, QNs)药物作为常见的合成抗菌素,是指一类具有 4-唾诺酮环结构的药物。它能抑制细菌DNA 螺旋酶,干扰 DNA 合成,具有抗菌谱广、高效、低毒等特点,广泛用于畜牧 和水产养殖,可用于水生动物细菌性疾病,如鱼类的烂腮病、 肠道疾病、细菌性赤皮病、竖鳞病、细菌性出血病、细菌性败 血症、赤皮病、溃烂病、赤鳍病等。而唾诺酮类药物可发生 中、重度光敏反应和光毒性反应,可致重症肌无力症状加重、 呼吸肌无力而危及生命,且有潜在的致癌性和遗传毒性,通过 任何途径摄入会在
人体中蓄积,致使许多细菌产生抗药性。唾 诺酮类药物在美国属水产养殖业的禁用药,在澳大利亚和新西
兰也属不得检出药物,检测限为0.1 »g/kg 。现有的检测方法
有微生物抑制法、酶联免疫法、放射免疫法、薄层谱法、液 相谱法、液相谱-质谱法、荧光光度法等〔一刃,GB/T  20366- 2006《动物源产品中唾诺酮类残留量的测定液相谱-串联质 谱法》的定量限最低购,为1.0 jig/kg,其中恩诺沙星、丹诺 沙星的检出低限为0.5 jig/kg,本实验建立了 QuEChERS 前处
理方法结合LC-MS/MS 内标法测定水产品中17种唾诺酮类药 物残留的检测方法,定量限为0.1 |xg/kg o
1材料与方法
1. 1试验材料
大黄鱼、红古鱼、餉鱼、罗非鱼等样品,来自于日常检测 样品。所有试验样品先采用GB/T  20366-2006《动物源产品中 唾诺酮类残留量的测定液相谱-串联质谱法》方法进行唾诺
酮类兽药残留检测,确认不含待研究的多种兽药残留。
1.2仪器与试剂
仪器:液相谱-质谱联用仪:Agilent  1290高效液相谱 仪,Agilent  6460三重四级杆质谱仪(配ESI 电喷雾离子源,美
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国Agilent公司);MiUi-Q Direct16超纯水机(美国MILUPORE 公司);ME1002E.XS105电子天平(瑞士METTLER TOLEDO);迷你振荡器(IKA公司);旋涡混合器(VORTEX-GENIE);3K15高速离心机(Sigma公司);UNIVERSAL320R 离心机(德国HETTICH公司);0~25mL瓶口移液器(Dispensette organic);全自动氮吹浓缩仪(美国Biotage公司)。
材料:15mL EMR-Lipid dSPE管,EMR polish粉包,陶瓷均质子(美国Agilent公司);Gilson移液及配套头;50mL 离心管;2mL进样瓶;10mL玻璃试管;1mL—次性针式注射器;Green Mall针式滤头(0.2pim)。
试剂:超纯水;甲醇、乙睛、二甲亚砚、甲酸、乙酸钱为谱纯(德国Merk公司);乙睛为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。
17种座诺酮类兽药标准品及13种内标物:Marbofloxacin (麻保沙星)、Marbofloxacin-D8、Fleroxac
in(氟罗沙星)、Ofloxacin(氧氟沙星)、Ofloxacin-D3、Pefloxacin(培氟沙星)、Pefloxacin-D5Enoxacin(依诺沙星)、Enoxacin-D8、Norfloxacin (诺氟沙星)、Norfloxacin-D5、Ciprofloxacin(环丙沙星)、Ciprofloxacin-D8、Enrofloxacin(恩诺沙星)、Enrofloxacin_D5、Danofloxacin(丹诺沙星)、Lomefloxacin(洛美沙星)、Lomefloxacin-D5、Orbifloxacin(奥比沙星)、Difloxacin(双氟沙星)、Difloxacin-D3、Sarafloxacin(沙拉沙星)、Sarafloxacin-D8、Spaifloxacin(司帕沙星)、Oxolinic acid(噁座酸)、Oxolinic acid-D5、Nalidixic Acid(蔡睫酸)、Nalidixic acid-D5、Flumequine(氟甲座)、Flumequine-13C3。
1.3液相谱条件
谱柱:ZORBAX Eclipse Plus C18柱(3.0x100mm, 1.8|xm;安捷伦公司);柱温:35t;流动相:A=甲醇(含0.l%(v/v)甲酸),B=0.47g/L乙酸钱水溶液(含0.l%(v/v)甲酸);梯度洗脱程序:0~2min,2%A~5%A;3~6min, 20%A~25%A;&5~12min,30%A~50%A;14-16min, 70%A~90%A;运行时间:20min;后运行时间:4min;进样量:10»L;流速:0.4mL/min。
1.4质谱条件
表117种IW诺酮类兽药的保留时间及质谱分析参数
365.bm990Table1Retention times and mass spectrometric parameters for the17Quinolones
No.Quinolones Retention time/min Transitions/(m/z)Fragmentor/V CE/eV 1Marbofloxacin(麻保沙星)7.456363.2/345.1*,363.2/319.811020,14 Marbofloxacin-DS7.42371.2/328.112812 2Fleroxacin(氟罗沙星)7.75370.1/326.2*,370.1/269.011018,28 3Ofloxacin(氧氟沙星)&39362.2/318.2*,362.2/261.114920,26 Ofloxacin-D38.37365.2/321.112820 4Pefloxacin(培氟沙星)&50334.2/316.1*,334.2/290.111020,16 Pefloxacin-D5&46339.2/321.112824 5Enoxacin(依诺沙星)&548321.1/303.1*,321.1/234.013018,20 Enoxacin-DS8.51329.2/311.112820 6Norfloxacin(诺氟沙星)&88320.1/302.0*,320.1/276.111020,17 Noifloxacin—D5&84325.2/307.112820 7Ciprofloxacin(环丙沙星)9.34332.1/314.1*,332.1/231.013018,42 Ciprofloxacin-D^9.27340.2/322.213520 8Enrofloxacin(恩诺沙星)9.73360.2/342.2*,360.2/316.28920,20 Enrofloxacin—D59.70365.2/347.115424 9Danofloxacin(丹诺沙星)9.8435&2/340.1*,35&2/255.011024,44 10Lomefloxacin(洛美沙星)10.03352.2/265.0*,352.2/334.015924,20 Lomefloxacin—D59.98357.2/270.015424 11Orbifloxacin(奥比沙星)10.34396.2/295.1*,396.2/352.115924,16 12Difloxacin(双氟沙星)10.51400.2/382.1*,400.2/356.111020,20 Difloxacin~D310.48403.2/385.112820 13Sarafloxacin(沙拉沙星)10.84386.1/368.1*,386.1/342.115024,20 Sarafloxacin—10.80394.2/376.115424 14Spaifloxacin(司帕沙星)11.94393.2/292.1*,393.2/349.216426,20 15Oxolinic acid(噁座酸)13.10262.1/244.0*,262.1/216.011016,30 Oxolinic acid-D513.07267.1/249.010216 16Nalidixic Acid(
蔡睫酸)14.51233.1/215.0*,233.1/187.011012,25 Nalidixic acid-D514.4623&1/220.010212 17Flumequine(氟甲座)14.76262.1/244.1*,262.1/202.010816,36 Flumequine-13C314.76265.1/247.010216 *Quantitative ion.
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离子源为ESI电喷雾离子源;采用正离子多反应监测(MRM)扫描模式采集数据;碰撞气为氮气;气流量10L/min;离子源温度345弋;毛细管电压3600V;光电倍增管电压200V;喷雾器压力43psi;其他质谱参数见表1。
1.5标准曲线制作
17种座诺酮类兽药标准贮备溶液:分别准确称取适量的标准品,用乙睛配制成100pug/rnL的标准贮备溶液;17种座诺酮类兽药混合中间标准溶液:准确移取适量的每种座诺酮类兽药标准贮备溶液,用乙睛配制成1.0pig/mL的混合中间标准溶液;再根据需要用0.47g/L乙酸钱水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)+乙月青(75+25)溶液逐级稀释成0.001、0.005、0.010、0.020、0.050、0.10ixg/mL的系列外标标准混合溶液A;17种座诺酮类兽药混合标准添加溶液5ng/mL:准确移取适量的座诺酮类兽药混合中间标准溶液,用乙月青配制成5ng/mL的标准添加溶液B。
13种座诺酮类兽药内标贮备溶液:分别准确称取适量的每种座诺酮类兽药内标物质,用乙睛配制成100Mg/mL的内标贮备溶液;13种座诺酮类兽药混合中间内标标准溶液:准确移取适量的每种座诺酮类兽药内标贮备溶液,用乙睛配制成1.0pcg/mL的混合中间内标标准溶液;13种座诺酮类兽药混合内标标准溶液:准确移取中间内标标准溶液,用乙睛配制成0.1|xg/mL的混合内标标准溶液C o
分别吸取0.1mL的系列外标标准混合溶液A、0.05mL的0.1|JLg/mL的混合内标标准溶液C,并加入0.85mL的0.47g/L 乙酸鞍水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)+乙睛(75+25)溶液,制作系列标准曲线,待上机。
1.6样品前处理方法
1.6.1样品前处理
准确称取5.00g研磨好的样品于50mL具盖高速离心管中,添加0.1iJug/mL的混合内标标准溶液C50uL o加入1.00mL 超纯水和两粒陶瓷均质子,涡旋混匀,然后加入8.00mL5%甲酸乙月青振荡提取(2500r/min,1min),高速离心10min (9500rpm);移取5.0mL5mM醋酸鞍水溶液到15mLEMR-Lipid dSPE管中,振荡1min(2500r/min),进行活化,将高速离心后的上层提取液转移到经过活化的EMR-Lipid dSPE管中,振荡1min(2500r/min),离心6min(5000r/min);将上清液倾倒到预加了两粒陶瓷均质子的50mL的离心管中,加入EMR polish粉包,快速剧烈振荡1min(2500r/min),离心6min (5000r/min);移取2.00mL乙月青液至10mL玻璃试管中,加入50|JiL DMS0,40弋水浴中氮气浓缩至剩
余液体约0.05mL o 向试管中加入0.950mL0.47g/L乙酸鞍水溶液(含0.l%(v/v)甲酸)+乙睛(75+25)溶液,漩涡混合1min o用1mL针式注射器吸取后经0.22jim滤膜过滤至2mL的进样瓶,供液相谱-质谱联用仪检测分析。
1.6.2基质标准工作溶液制备
准确称取8个5.00g研磨好的基质空白样品于50mL具塞高速离心管中,分别加入0、0.050、0.1、0.1、0.2、0.4、1.0、2.0mL5ng/mL的标准添加溶液B,旋涡混匀。按1.6.1方法进行前处理后装于进样瓶,供液相谱-质谱联用仪检测分析。
1.7添加回收
变压器油泵
准确称取48个5.00g研磨好的基质空白样品于50mL具塞高速离心管中,分三天分别加入0、0.050、0.1、0.1、0.2、0.4、1.0、2.0mL5ng/mL的标准添加溶液B,旋涡混匀,使 用1.6.1方法进行前处理后装于进样瓶,供液相谱-质谱联用仪检测分析。
2结果与讨论
2.1谱图
在上述前处理及谱、质谱条件下,17种兽药均可实现快速、有效的分离。图1为液相谱-串联质谱同时检测17种兽药及13种内标物的MRM谱图。
+MRM(371.2->328.1)58.d
xl02_
1.4-
1.2-
1-
0.8-
0.6-
微孔抛光镜面加工0.4-
7.415min.
+MRM(339.2->321.1)58.d xlO2'
5Acquisition time/min Acquisition time/min
+MRM(329.2->311.1)58.d
xl0\
4
pva抛光轮
智能缓存23
°2
1
0-
Acquisition time/min
Acquisition time/min 6.877.27.47.67.8
Acquisition time/min
4
□3
°2
1
0-__________________________
i i i i i i r
88.28.48.68.89
Acquisition time/min Acquisition time/min
I I I I I
88.28.48.68.8
9
90广州化工2021年6月
Acquisition  time/min Acquisition  time/min
Acquisition  time/min
Acquisition  time/min
Acquisition  time/min
+ MRM(3i xlO 3 -0.8-
铁路道口声光报警器巴 0.6-U  0.4-
0.2-0-
65.2-> 347.1)58.9.6d
95 min.1 1 1  1 9 9.2 9.4 9.6 9.8 10Acquisition  time/min
Acquisition  time/min
+ MRM  (360.2 -> 342.2)58.d
xlO 39.730 min.A
1.75-J 1.5-1 1.25-
g 1-■° 0.75-bl
0.5-0.25-/ n
_____1 J
0-1 1  1  1 9 9.2 9.4 9.6 9.8 10Acquisition  time/min
Acquisition  time/min Acquisition  time/min Acquisition  time/min  Acquisition  time/min
Acquisition  time/min Acquisition  time/min + MRM  (386.1 -> 368.1)58.d
Acquisition  time/min + MRM  (267.1 -> 249.0) 58.d
Acquisition  time/min Acquisition  time/min
Acquisition  time/min Acquisition  time/min Acquisition  time/min
Acquisition  time/min Acquisition  time/min
图1 17种兽药及13种内标物的MRM 谱图Fig. 1 MRM  chromatograms  of  theQuinolones
standards
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2.2方法的准确度、精密度及灵敏度
用本方法对大黄鱼样品进行0、0.050、0.1、0.1、0.2、0.4、1.0、2.0fjig/kg水平的加标回收实验,以待测物的峰面积(y)对相应的含量(jJLg/kg)制作加标回收校准曲线,外标法定量,以待测物与内标物峰面积比值(y)对相应的含量(fig/kg)制作加标回收校准曲线,内标法定量,实验结果其相关系数(疋)均大于0.99,17种兽药在0.05-2.0»g/kg范围内具有良好的线性关系。同时用本方法对大黄鱼、鲂鱼样品进行6次0.1»g/kg水平的加标实验,其回收率为84.9%-111.5%,相对标准偏差(RSD)为5.29%-22.66%(见表2)。以信噪比S/N >10确定方法定量下限,17种兽药的定量下限均可达到0.1"g/kg,结果较为理想。
表217种兽药线性方程、相关系数、回收率、精密度
Table2Regression equation,correlation coefficient(R2),recovery and relative standard deviations
No.Quinolones Regression equation R2Yellow croaker(0.1|xg/kg)Perch(0.1jjig/kg)Recovery/%RSD/%Recovery/%RSD/%
1Marbofloxacin(麻保沙星)y=0.412755x+0.003900.990292.215.26103.017.45 2Fleroxacin(氟罗沙星)y=2752.6441x+4.514780.990484.917.8190.322.66 3Ofloxacin(氧氟沙星)y=0.129236x+0.066690.9915101.610.05105.7&29 4Pefloxacin(培氟沙星)y=0.260102x+0.1190900.997289.114.80100.112.09 5Enoxacin(依诺沙星)y=0.235673x+0.0748260.998094.47.67105.6&94 6Norfloxacin(诺氟沙星)y=0.109932x-0.0139740.9966111.5  5.9794.08.39 7Ciprofloxacin(环丙沙星)y=0.094907x+0.0874850.991093.212.99102.113.32 8Enrofloxacin(恩诺沙星)y=0.107875x+0.1482270.9986101.58.09102.811.07 9Danofloxacin(丹诺沙星)y=9473.683x-10&76740.998095.37.299&813.11 10Lomefloxacin(洛美沙星)y=07.12944x-0.0069190.995787.315.96102.816.03 11Orbifloxacin(奥比沙星)y=4507.9126x-82.33690.9988786.99.80103.211.49 12Difloxacin(双氟沙星)y=0.211050x-0.0186870.9969100.47.55104.7  5.29 13Sarafloxacin(沙拉沙星)y=0.218308x-0.0293040.991298.611.54102.5  6.51 14Sparfloxacin(司帕沙星)y=2529.7389x-86.62300.995095.99.2310&27.31 15Oxolinic acid(噁哇酸)y=0.092736x+0.0032220.9990102.2  5.
8995.8  5.54 16Nalidixic Aci<l(蔡睫酸)y=0.102023x-0.0054820.9963107.39.7910&07.70 17Flumequine(氟甲唾)y=0.108178x-0.0056040.9995110.0  6.0299.810.01
3讨论
3.1样品提取条件的优化
用于提取样品中兽药常用的有机溶剂有甲醇、乙睛、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷和正己烷等,本文所检测的17种唾诺酮类兽药,3位有竣基,4位有酮按基,酸性或碱性均有利于其提取。实验比较了含5%甲酸的乙睛溶液、乙睛、5%氨水的乙睛溶液、乙酸乙酯等溶剂,发现含5%甲酸的乙睛溶液的提取效率最好,因此选其作为提取溶剂。
3.2净化条件的选择
QuEChERS方法适用于低脂肪含量的高含水基质,如大部分的水果蔬菜,而动物源性食品的蛋白质及脂肪含量高、基质复杂,常常是冷冻样品。现有的QuEChERS净化用吸附剂C18EC去除脂类和固醇,PSA去除极性的有机酸、一些糖类和脂类,面对高脂肪基质吸附能力有限,如果未经净化直接检测,将影响分离效果和检测灵敏度。本文选用的EMR-Lipid dSPE管,疏水选择性结合空间选择性,经水活化后可选择性吸附直链桂类脂肪(游离脂肪酸、甘油三酯、胆固醇、磷脂),净化效果好,因此选其作为净化用吸附剂。
3.3定容溶剂的选择
对于定容溶剂的选择,对比了不同比例的乙睛乙酸钱水溶液(0、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%),当乙睛比例为25%(v/v)时,大部分兽药回收率最高,仅5种外标和4种内标回收率略下降,因此最终确定以0.47g/L乙酸钱水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)+乙睛(75+ 25)溶液为定容液时,17种兽药均有较好的回收率。
3.4液相谱、质谱条件的优化
比较了甲醇(含0.l%(v/v)甲酸)、乙睛分别与0.47g/L 乙酸钱水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)和0.5%(v/v)甲酸水溶液组成的流动相系统的洗脱效果,结果表明,采用甲醇(含0.1%(v/v)甲酸)和0.47g/L乙酸皱水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)作为流动相时,仅2种外标和2种内标响应值略低,因此最终确定以甲醇(含0.1%(v/v)甲酸)+0.47g/L乙酸钱水溶液(含0.l%(v/v)甲酸)为流动相时,17种兽药均有较高的响应值。
在ESI电喷雾离子源正离子模式下,分别对各目标物的标准溶液进行全扫描和子离子扫描,确定定量、定性离子对,再分别进行优化碎裂电压和碰撞能量等参数,优化结果见表1。
4结论
本文以大黄鱼、餉鱼、红古鱼、餉鱼、罗非鱼等水产品为研究对象,建立了QuEChERS前处理方法结合LC-MS/MS内标法测定水产品中17种唾诺酮类药物残留的检测方法,方法具有良好的精密度、较低的方法定量限和较稳定的回收率,能满足实际样品中多种唾诺酮类药物同时检测,也为其他兽药残留检测方法提供了参考。
(下转第104页)

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