高效液相谱-串联质谱法测定婴幼儿奶粉中核苷酸

第42卷第1期2021年1月
Vol42No1
Jan'2021
质谱学报
JournalofChinese MassSpectrometrySociety
高效液相谱-串联质谱法
测定婴幼儿奶粉核苷
陈晶燕,陈万勤,王峰,陈,周霞,刘柱,梁晶晶
(浙江省食品药品检验研究院,浙江杭州310052)
摘要:建立了高效液相谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定婴幼儿奶粉中胞嘧啶核苷酸(CMP)、腺嘌吟核苷酸(AMP)、鸟嘌吟核苷酸(GMP)、尿嘧啶核苷核(UMP)、次黄嘌吟核苷酸(IMP)等5种核苷酸含量。使用碱性磷酸酶去磷酸化作用,把样品中的核苷酸水解成相应核苷,经选择性硼酸固相
萃取净化,ACQUITY UPLC HSS T3(2.1mmX100mmXi.8"m)谱柱分离,以5mmol/L甲酸铵溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱。采用电喷雾正离子源,内标法定量,以多反应监测(MRM)模式进行质谱分析°结果表明,奶粉中5种核苷在各自线性范围内的线性关系良好,相关系数均大于0.998,回收率为
74.2%〜110.7%,相对标准偏差在0.8%〜5.3%之间(n=6),CMP、AMP、GMP、UMP、IMP的定量限
分别为0.7、0.1、0.7、3.3、0.6mg/100g°该方法灵敏度高、重现性好、定量准确,可用于测定婴幼儿奶粉中核苷酸含量°
关键词:高效液相谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS);奶粉;核苷酸;核苷;多反应监测(MRM)
中图分类号:O657.63文献标志码:A文章编号:10042997(2021)01009308
doi:10.7538/zpxb.2019.0156开放科学(资源服务)标识码(OSID):
Determination of Nucleotides in Infant Milk Powder by High
Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
CHENJing-yan,CHEN Wan-qin,WANG Feng,CHEN Bi-lian,
ZHOU Xia,LIU Zhu,LIANGJing-jing
(.Zhejiang Institute for Food and Drug Control,Hangzhou310052,China)
Abstract:Nucleotides are biologically important small molecules composed of a nitroge-nousbase,afive-carbon sugar(ribose or deoxyribose)and at least one phosphate group.Theyplayimportantroleinimprovinggastrointestinaltractrepairafterdamage, maintainingtheimmunesystem andregulatinglipoprotein metabolism.Nowadaysthe roleofdietarynucleotideshasbeenpaidincreaseda t entionininfantnutrition.Dietary nucleotidesarecrucialtomaintainingnormalgrowthanddevelopmentininfants.There-forethecontentsofnucleotidesininfantmilkpowderbecomeimportant.A methodfor
收稿日期:2019-11-15;修回日期:2020-03-10
基金项目:浙江省市场监管局项目(018007)浙江省食品药品监督管理局科技计划项目(019002)资助
作者简介:陈晶燕(1993—),女(汉族),浙江杭州人,助理研究员,从事分析化学研究。E-mail:506135953@qq
通信作者:陈万勤(1983—),男(汉族),浙江温州人,高级工程师,从事分析化学研究。E-mail:*******************
94质谱学报第42卷
the determination of five nucleotides(cytidine5^-monophosphate(CMP),guanosine5*-monophosphate(GMP),uridine5^-monophosphate(UMP),adenosine5*-monophos-phate(AMP)and inosine5^-monophosphate(IMP))in infant milk powder by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)was deve&oped.Thenuc&eotidesinsamp&e werehydro&yzedbya&kainephosphatasetothe corresponding nuc&eosides.The nuc&eosides were adsorbed by se&ective boric acid so id phase extraction.After purification and e&ution"the chromatographic separation was performed on an ACQUITY UPLC HSS T3column(2.1mmX100mmX1.8g m),and gradiente&uted by5mmo&/L ammonium formate and aceton
itrie"and ana&yzed by HPLC-MS/MSin mu&tip&ereaction monitoring(MRM)modeviapositivee&ectrospray ionization.The contents of nucleotides were quantitatively analyzed by internal standard method.Theresultsshowedthatthelnearrangesoffvenucleot2des2n2nfantformula aregood"thecorrelat2oncoe f2c2entsareabove0.998.F2vek2ndsofnucleos2descanbe separatedw2th2n8m2n.Cyt2d2ne"2nos2neandguanos2nearea l lnear2ntheconcentra-tion range of5-200"g/L,adenosine and uridine are linear in the concentration range of 1-40"g/L and25-1000"g/L,respectively.The recoveries are between74.2%and 110.7%with the relative standard deviations from0.8%to5.3%(/=6).The limits of quantitation of CMP,AMP,GMP,UMP and IMP are0.7,0.1,0.7,  3.3,0.6mg/100g, ur.cyofthe milk powder were .n.lyzed.Themethodissensitive"."h.sgoodreproducibility.ndissuit.formul.products.
Key words:high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS);milk powder;nucleotides;nucleosides;multiple reaction monitoring (MRM)
核苷酸是由含氮碱基、核糖或脱氧核糖和磷酸3种分子连接形成的化合物,主要有胞嘧啶核苷酸(CMP)、鸟嘌呤核苷酸(GMP)、腺嘌呤核苷酸(AMP)、尿嘧啶核苷酸(UMP)以及次黄嘌呤
核苷酸(IMP)等5种。核苷酸是生物体内关键的含氮化合物之一,是各种核酸的基本组成单位’核苷酸对于婴幼儿的正常和良好发育发挥着关键作用,外源性核苷酸在摄入后能够被生物体消化吸收、代谢、转运’在婴幼儿奶粉中添加核苷酸对婴儿的生长发育有促进作用,可以提供免疫刺激、促进修复肠道损伤、促进肠道有益菌生长等+13。婴幼儿奶粉中的核苷酸含量是衡量奶粉营养的重要参数之一。很多国家制定了婴幼儿奶粉中核苷酸含量的相关标准,我国规定婴幼儿配方食品中允许添加的核苷酸使用总量为0.12〜0.58g/kg4。
目前,在核苷酸含量的检测过程中,样品前处理方法包括固相萃取法5、酶解法⑷和沉淀杂质法7,定量检测方法主要包括高效液相谱法时0,、毛细管电泳法+1112以及高效液相谱-质谱联用法[1315]等。奶粉中核苷酸含量的检测受到许多因素的干扰,如高含量的蛋白质和脂肪杂质。核苷酸含有磷酸基团,其酸性强、极性大,普通反相液相谱柱难以实现对核苷酸良好的保留和分离。2016年,我国颁布了核苷酸的检验新标准+16,但是该标准在处理奶粉等复杂样品时前处理简单,未进行进一步净化处理,由于核苷酸中CMP极性较强,出峰时间过早,基质干扰严重,不利于样品的准确定量。此外,流动相含有离子对试剂,导致平衡时间过长,谱柱寿命大幅缩短。
本研究拟采用碱性磷酸酶脱去核苷酸上的磷酸基团,水解成相应的核苷,降低被测样品目标物的极性。通过选择性硼酸固相萃取净化, HPLC-MS/MS分析,根据核苷酸和核苷之间的
第1期陈晶燕等:高效液相谱-串联质谱法测定婴幼儿奶粉中核苷酸95
转化系数计算婴幼儿奶粉中5种核苷酸含量。
1实验部分
1.1仪器与试剂
Triple Quad5500液相谱-质谱联用仪:美国AB SCIEX公司产品;恒温振荡器、涡旋混合器:德国IKA公司产品;高速离心机:美国Thermo公司产品;氮气吹干仪:天津市恒奥科技有限公司产品。
甲醇、乙腈:谱级,德国Merck公司产品;甲酸、乙酸铵、氨水:谱级,美国Sigma公司产品;Affi-gel601:美国Bio-Rad Laborato­ries公司产品;碱性磷酸酯酶(来自牛肠黏膜):美国Sigma公司产品;实验用水:由Milii-Q型超纯水仪制备。
胶囊模具胞嘧啶核苷酸(CMP)(纯度"99%)、鸟嘌吟核苷酸(GMP)(纯度"99%)、尿嘧啶核苷酸(UMP)(纯度"98%)、次黄嘌吟核苷酸(IMP)(纯度"98%)、腺嘌吟核苷酸(AMP)(纯度" 97%)、尿嘧啶核苷(U)(纯度"99%)、胞嘧啶核苷(C)(纯度"99.0%)、腺嘌吟核苷(A)(纯度"99%)、次黄嘌吟核苷(I)(纯度"99%)、鸟嘌吟核苷(G)(纯度"98%)标准品:均为美国Sigma Aldrish公司产品;1-i3C胞嘧啶核苷(纯度100%)、1',2',3',4',5-3C鸟嘌吟核苷(纯度100%)、i,2',3',4',5-i3C次黄嘌吟核苷(纯度100%)内标物质:均为美国Omicron Biochemicals公司产品。
1.2标准溶液的配制
1.2.1储备标准溶液核苷储备标准溶液:准确称取10mg各核苷,用0.1mol/L NaOH溶液溶解,定容至10mL容量瓶中,配制成约1.0 g/L标准储备液,于2〜8e储存。
核苷酸储备标准溶液:准确称取10mg各核苷酸,用水溶解,定容至10mL容量瓶中,得到io g/L标准储备液,于2〜8e储存。
1.2.2混合标准中间液核苷混合标准中间液:分别准确量取适量的核苷储备标准溶液于5mL容量瓶,用水定容,配制成鸟苷、胞苷、次黄嘌吟核苷为40mg/L,腺苷为8mg/L,尿苷为200mg/L的核苷混合标准中间液。
核苷酸混合标准中间液:分别准确量取适量的核苷酸储备标准溶液于5mL容量瓶,用水定容,配制成鸟苷酸、胞苷酸、次黄嘌吟核苷酸为40mg/L,腺苷酸为8mg/L,尿苷酸为200mg/L的核苷酸混合标准中间液。
1.2.3内标储备液分别准确称取大约10mg的i-3C胞嘧啶核苷、i,2',3',4',5-3C 次黄嘌吟核苷和i,2',3',4',5-3C鸟嘌吟核苷,用70%甲醇水溶液溶解并定容至10mL容量瓶中,得到#0g/L的各内标储备液,于2〜8e储存。
1.2.4内标混合工作液移取0.1mL各内标储备液于10mL容量瓶,用水定容,得到10mg/L的内标混合工作液,于2〜8e储存。
智能支付1.2.5混合工作标准液取适量的核苷混合标准中间液于5个10mL容量瓶中,分别加入0.1mL内标混合工作液,纯水定容并充分混合后,转移到自动进样瓶内,进行HPLC-MS/MS 分析。
陶瓷膜过滤系统1.3样品前处理
1.3.1碱性磷酸酶溶液配制取20"L碱性磷酸酯酶试剂,用5mL0.5mol/L醋酸铵(pH8.75)将上述酶试剂完全溶解后,保存在4e冰箱中,待用。所配制的酶试剂含量约为12U/50"L。
1.3.2硼酸亲和凝胶制备准确量取50mL 0.1mol/L磷酸钾(pH  6.5)于150mL烧杯中,加入5g Affi-gel601亲和凝胶,盖上金属铝箔,持续搅拌4h。用50mL0.25mol/L磷酸钾(pH10.5)清洗凝胶2次,再向凝胶中加入100mL0.25mol/L磷酸钾(pH10.5),强力涡旋离心管分散凝胶。将0.7mL亲和胶浆体等份转移到带有扣盖的2mL离心管中,待用。1.3.3样品制备将核苷酸在碱性磷酸酶作用下水解成腺嘌吟核苷,示于图1准确称取10g奶粉,用温水充分溶解并定容于100mL 容量瓶中,准确移取1mL至10mL离心管。向离心管中加入1mL0.5mol/L醋酸铵溶液(pH875)、50"L30%浓氨水、50"L1mol/L 氯化镁溶液、50"L10mmol/L硫酸锌溶液和50"L碱性磷酸酶溶液,混匀后,在(37+2)e 恒温摇床中以165r/min振荡2h,取出离心管,分别多次加入1
2.5mL0.5mol/L磷酸钾溶液,将离心管中溶液转移至20mL容量瓶中,用水定容,摇动混匀,待硼酸凝胶净化。
96
质谱学报 第42卷
图1在碱性磷酸酶作用下,腺嘌吟核苷酸水解成腺嘌吟核苷
Fig. 1 Hydrolysis  of  adenosine  nucleotide  to  adenosine  nucleoside  at  alkaline  phosphatase
1. 3・4样品净化 取预先分装好0. 7 mL  A ffi-
gel  601的2 mL 离心管,以2 000 r /min 离心
3 min,去除上清液。分别加入1 mL  0. 25 mol/L  磷酸冲洗凝胶和磷酸钾缓冲液(pH  10.5),涡旋
离心,去除上清液。再次加入1 mL  0.25 mol/L  磷酸钾缓冲液(pH  10.5),涡旋放置10〜15 min ,
使凝胶完全转化为碱性形式,离心,去掉上清液-向凝胶中加入1 mL 样品溶液和0. 1 mL
10 mg/L 内标混合工作液,振荡10〜15 min ,
以2 000 r /min 离心3 min ,去掉上清液;用
1 mL  0. 25 mol/L 磷酸钾缓冲液(pH  10. 5)冲 洗 凝 胶 "以 2)))r / min  离 心 3 min "去 掉 上 清
液;再用1 mL 水冲洗凝胶,以2 000 r/min 离 心3 min,去掉上清液。加入250 "L  5%甲酸
水溶液,涡旋30 s 分散凝胶并释放出核苷,再
加入1. 75 mL 甲醇,转移至15 mL 离心管。40 °C  氮气吹至液面低于1 mL,用纯水定容至5 mL ,
0.22 g m 水相微孔滤膜过滤后,转移至样品瓶
中,待LC-MS/MS 分析。
<4 实验条件
1. 4. 1 谱条件 谱柱:ACQUITY  UPLC
HSS  T3 柱(2. 1 mm  X  100 mm  X  1. 8 g m );流
动相:A 为5 mmol/L 甲酸铵(pH  6.0),B 为乙
腈;梯度洗脱程序:0〜3.0 min(1%B),3.0〜
4. 5 min(1 % 〜10%B),4. 5 〜
5. 0 min  (10 % 〜 40%B ) ,5. 0〜8. 0 min(40%B ) ,8. 0〜8. 5 min
(40% 〜1%B),8.5 〜14.0 min(1%B);流速: 0. 3 mL/min  ;柱温:35 C  ;进样量:2 "L 。
1・4. 2质谱条件 电喷雾离子源(ESI ),正离 子扫描模式;电喷雾电压5 500 V ;离子源温度
500 C 。5种核苷和3种内标物的监测离子对
及相关参数列于表1'
表1 8种化合物的质谱参数
Table  1 Mass  spectrometric  parameters  of  8 compounds
化合物
Compound
母离子
Parent  ion  (m/z)子离子
Product  ion  (m %z )碰撞电压Colision
energy /eV
去簇电压 Declustering  potential/V
保留时间 Retention
time %min 1-13C 胞嘧啶核苷245. 1##2.0 $20
35  1. 76
95.#
563512345-3C 鸟嘌吟核苷289. 2152. 0$#930  5.44
堆栈式135. 0
493012345-3C 次黄嘌吟核苷
274.#
137. 1$#5
30  4.86
##0.05530次黄嘌吟核苷
269.0
137. 0$#640  4.86##9.05440胞嘧啶核苷
244.0
##2.0 $
#8
40  1. 76
95.05540尿嘧啶核苷
245.0##3.0 $#940  2.45
96. 046
40腺嘌吟核苷
268.0
#36.0 $2440  6.94
##9.0
6340
鸟嘌吟核苷
284.0152. 0$22
32  5.44
135. 0
52
32
注:$
为定量离子
第1期陈晶燕等:高效液相谱-串联质谱法测定婴幼儿奶粉中核苷酸97
2结果与讨论
2.1前处理方法的优化
婴幼儿奶粉组分复杂,包含蛋白质、脂肪、维生素和矿物质等,样品提取后需净化才能进行HPLC-MS/MS分析。奶粉中核苷酸在碱性磷酸酶催化下水解成相应的核苷,再通过选择性硼酸固相萃取将核苷预分离。此时,在碱性条件下,干扰化合物会从凝胶上去除。
辐照灭菌设备实验对比了Waters Oasis MCX(150mg, 6mL)Waters Oasis HLB(200mg,6mL)、Affi-gel601凝胶)3种固相萃取柱的净化效果。结果发现,利用MCX柱处理核苷标准品溶液时,未能完全保留5种核苷,其中尿苷在谱中未出峰;HLB柱对胞苷、尿苷未能保留,在谱中未出峰;而Affi-gel601凝胶对5种核苷化合物保留较好。因此,选择Affi-gel 601凝胶用于核苷净化。将样品溶液加入制作好的预备凝胶,在样品吸附于凝胶后,用磷酸钾溶液冲洗凝胶除去杂质,再用超纯水清洗凝胶,去除非挥发性的磷酸盐,降低其对质谱仪和谱柱的损耗。通过这种方式,样品中的核苷完全保留于凝胶中,可以进行下一步洗脱步骤。
实验分别比较了5%、10%、20%甲酸水溶液对核苷洗脱效果的影响。结果发现,甲酸浓度对核苷洗脱的效果影响不大,其回收率均在91.67%〜103.03%之间。考虑到甲酸浓度会对质谱仪和谱柱产生影响,因此选用最低浓度的5%甲酸水溶液进行洗脱。2.2谱条件的优化
在相同的流动相下,分别考察了CORTECS C18(2.1mmX1))mmX2.7"m)和ACQUITY
UPLC HSS T3(2.1mmX1))mmX1.8"m)谱柱对5种核苷的分离效能。发现5种核苷在ACQUITY UPLC HSS T3谱柱上均有较强的保留,各化合物均能得到较好的分离,且峰形良好。本实验选择5mmol/L甲酸铵(A 相)和乙腈(B相)作为流动相进行梯度洗脱,并优化洗脱程序,5种核苷标准品的提取离子流谱图示于图2。
2.3质谱条件的优化
根据核苷结构,采用电离源正离子模式,使用AB5500液相谱-质谱联用仪的MSONLY 模式对i0mg/L的5种核苷和3种内标物的单标溶液进行质谱条件优化,得到各化合物的母离子、主要碎片离子、最佳碰撞电压(collision energy,CE)和去簇电压(declustering poten­tial,DP),列于表1。
注:U.尿嘧啶核苷;G.鸟嘌吟核苷;
C.胞嘧啶核苷;A.腺嘌吟核苷;I.次黄嘌吟核苷
图25种核苷标准品的提取离子流谱图
Fig.2Extractedionchromatogram三菱plc学习机
of5nucleosidestandards
2.4方法学考察
2.4.1线性范围本实验米用内标法定量,将核苷标准溶液用水稀释为不同浓度的标准系列工作液,向每个样品瓶中加入等量的100"g/L 3种同位素内标溶液,用超纯水定容,配制成鸟苷、肌苷、胞苷为5、10、20、50、100、200"g/L,腺苷为1、2、4、10、20、40"g/L,尿苷为25、50、100、250、500、1000"g/L的核苷系列标准工作液。在优化的仪器条件下检测,用定量离子的峰面积5)对质量浓度(工)进行线性回归,计算5种核苷的线性方程和相关系数,结果列于表2。可见,5种核苷在各自线性范围内的线性关系良好,相关系数均大于0.998。
2.4.2检出限、定量限、回收率和精密度采用基质液添加各化合物标准溶液,以3倍信噪比(S/N)为检出限,10倍信噪比为定量限,结合化合物在奶粉中允许添加的含量,确定CMP、AMP、GMP、UMP、IMP的检出限分别为0.21.0.0
3.0.21.0.99.0.18m g/100g,定量限分别为0.7、0.1、0.7、3.3、0.6mg/100g。核苷-核苷酸转化系数列于表3

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