蛛丝蛋白的碱性纯化的制作方法


蛛丝蛋白的碱性纯化
1.相关申请
2.本技术要求2018年11月28日提交的美国临时专利申请第62/772,588号的优先权,其内容通过引用以其整体并入本文。
3.序列表
4.本技术包含序列表,其已通过efs-web提交并通过引用以其整体并入本文。所述ascii副本创建于20xx年xx月,命名为xxxxxus_sequencelisting.txt,文件大小为x,xxx,xxx字节。


背景技术:



5.蜘蛛的丝多肽为大(》150kda,》1000个氨基酸)多肽,其可以分解成三个结构域:n-末端非重复性结构域(ntd)、重复性结构域(rep)和c-末端非重复性结构域(ctd)。ntd和ctd相对较小(分别为约150、约100个氨基酸),研究充分,并且据信赋予多肽水稳定性(aqueous stability)、ph值敏感性和聚集后的分子排列。ntd也具有强预测性分泌标签,该标签往往在异源表达过程中被除去。重复区域占天然多肽的约90%,并折叠成结晶和无定形区域,这些区域分别赋予丝纤维强度和柔韧性。
6.丝多肽来自多种来源,包括蜜蜂、蛾、蜘蛛、螨和其他节肢动物。一些生物体制造出多种具有特定序列、结构元素和力学性质的丝纤维。例如,圆形织网(orb weaving)蜘蛛具有六种产生不同丝多肽序列的独特类型的腺体,这些丝多肽序列可聚合成适合环境或生命周期微环境(niche)的纤维。该纤维以其来源的腺体命名,多肽则用腺体缩写(例如“ma”)和蛛丝蛋白(蜘蛛丝心蛋白的简称)的“sp”标记。在圆形织网蛛中,这些类型包括大壶状腺(masp,也称为拖丝)、小壶状腺(misp)、鞭状腺(flag)、葡萄状腺(acsp)、管状腺(tusp)和梨状腺(pysp)。这种跨纤维类型、结构域以及不同生物体属和物种间变异的多肽序列组合产生可通过重组纤维的商业生产加以利用的各种潜在特性。迄今为止,大部分关于重组丝的工作集中于大壶状腺蛛丝蛋白(masp)。
7.目前,重组丝纤维不能商购获得(除了少数例外),在大肠埃希菌(escherichia coli)和其他革兰阴性原核生物之外的微生物中无法产生。迄今为止生产的重组丝主要由聚合的短丝序列基序或原始重复结构域的片段组成,所述原始重复结构域有时与ntd和/或ctd组合在一起。这导致使用细胞内表达进行重组丝多肽的小规模生产(实验室规模下为毫克,生物加工规模下为千克),并通过层析或本体沉淀进行纯化。这些方法无法产生能够与现有技术和纺织纤维的价格竞争的可行的商业可扩展性。已经用于制造丝多肽的另外的生产宿主包括转基因山羊、转基因蚕和植物。这些宿主尚未能进行丝的商业规模生产,可能是工程化周期缓慢和可扩展性不良所致。
8.此外,重组丝多肽在生产和纯化过程中形成不合需要的不溶性聚集体。纯化期间重新增溶肽的方法往往会使蛋白质降解,导致纤维的收率较低,纤维的韧性低,手感较差。此外,标准蛋白增溶方法需要使用离液剂(chaotrope),诸如尿素、盐酸胍或硫氰酸胍,这些离液剂在蛋白质分离后必须被收集起来并加以适当处置。因此,需要改良的方法以在可持
续且环境友好的工艺中纯化这些多肽。


技术实现要素:



9.在一个方面,本文提供了从宿主细胞培养物中分离出重组蛛丝蛋白的方法,其包括:获得细胞培养物,其中所述细胞培养物包含宿主细胞和生长培养基,其中所述宿主细胞表达重组蛛丝蛋白;收集所述细胞培养物的包含所述重组蛛丝蛋白的部分;在碱性条件下将所述细胞培养物的所述部分在水溶液中孵育,从而将所述重组蛛丝蛋白增溶在所述水溶液中;以及从所述水溶液中分离出重组蛛丝蛋白,从而产生分离的重组蛛丝蛋白样品。
10.在一些实施方案中,碱性条件包括9至14的碱性ph值。在一个实施方案中,碱性ph值是11至12。
11.在一些实施方案中,分离的重组蛛丝蛋白是全长重组蛛丝蛋白。在一个实施方案中,分离的重组蛛丝蛋白样品包含相对于总的分离的重组蛛丝蛋白的至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的全长重组蛛丝蛋白。在一个实施方案中,全长重组蛛丝蛋白的百分比是用蛋白质印迹法测量的。在另一个实施方案中,全长重组蛛丝蛋白的百分比是用尺寸排阻谱法测量的。
12.在一些实施方案中,分离的重组蛛丝蛋白的纯度为5-10%、10-15%、15-20%、20-25%、25-30%、30-35%、35-40%、45-50%、50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%、75-80%、80-85%、85-90%、90-95%或95-100%。在一些实施方案中,分离的重组蛛丝蛋白的收率相对于通过尿素或硫氰酸胍法分离的重组蛛丝为至少50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%、75-80%、80-85%、85-90%、90-95%或95-100%。
13.在一些实施方案中,分离重组蛛丝蛋白包括通过改变所述水溶液的所述碱性条件来沉淀重组蛛丝蛋白。在一个实施方案中,改变所述碱性条件包括将所述细胞培养物的所述部分的碱性ph值调节至从4至10的降低的ph值。在一个实施方案中,降低的ph值为4、5、6、7、8、9或10的ph值。在一个实施方案中,降低的ph值为从6至7的ph值。
14.在一些实施方案中,调节碱性ph值包括向水溶液中加入酸。在一个实施方案中,酸是h2so4。
15.在一些实施方案中,所述细胞培养物的所述部分包含上清液、全细胞肉汤或细胞团块。在一些实施方案中,收集所述细胞培养物的所述部分包括从所述生长培养基中移出所述宿主细胞并在所述水溶液中重构所述宿主细胞。
16.在一些实施方案中,收集所述细胞培养物的所述部分包括裂解所述宿主细胞。在许多实施方案中,裂解包括热处理、剪切破坏、物理匀质化、超声或化学匀质化。
17.在一些实施方案中,所述细胞培养物的所述部分包含所述宿主细胞和来自所述细胞培养物的所述生长培养基。
18.在各种实施方案中,所述水溶液包含稀释的生长培养基。
19.在一些实施方案中,其中在碱性条件下孵育所述细胞培养物的所述部分10至120分钟。在一些实施方案中,在碱性条件下孵育所述细胞培养物的所述部分至少10分钟、至少15分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少60分钟、至少75分钟、至少90分钟、至少105分钟或至少120分钟。在一些实施方案中,在碱性条件下孵育所述细胞培养物的所述部分15至30分
钟。
20.在各种实施方案中,在碱性条件下孵育所述细胞培养物的所述部分进一步包括搅拌所述细胞培养物的所述部分。
21.在各种实施方案中,所述方法进一步包括在碱性条件下从所述水溶液中除去未被增溶的生物质。在一些实施方案中,除去未被增溶的生物质包括过滤、离心、重力沉降、吸附(adsorption)、透析或相分离。在一些实施方案中,过滤是超滤、微滤或透析过滤。在一些实施方案中,其中除去未被增溶的生物质被重复至少一次。
22.在各种实施方案中,所述方法进一步包括在分离重组蛛丝蛋白之前或者在分离重组蛛丝蛋白之后除去杂质。在一些实施方案中,除去杂质包括过滤、离心、重力沉降、吸附、透析或相分离。在各种实施方案中,过滤是超滤、微滤或透析过滤。在一些实施方案中,离心是超速离心或透析离心(diacentrifugation)。在一个实施方案中,吸附是炭吸附。在一些实施方案中,杂质去除被重复至少一次。
23.在各种实施方案中,所述方法进一步包括浓缩分离的重组蛛丝蛋白以产生浓缩的蛛丝蛋白。在一些实施方案中,浓缩包括沉淀、过滤、超滤、离心、透析、蒸发或冻干。
24.在各种实施方案中,所述方法进一步包括干燥分离的重组蛛丝蛋白。
25.在各种实施方案中,所述方法进一步包括由分离的重组蛛丝产生丝纤维。在一个实施方案中,所述丝纤维包括至少19cn/tex的韧性。
26.在一些实施方案中,所述重组蛛丝蛋白为18b或p0。
27.在一些实施方案中,细胞培养物包括真菌细胞、细菌细胞或酵母细胞。
28.在一些实施方案中,酵母细胞是巴斯德毕氏酵母(pichia pastoris)细胞。
29.在另一个方面,本文提供了分离重组蛛丝蛋白的方法,所述方法包括:获得细胞培养物,其中所述细胞培养物包含宿主细胞和生长培养基,其中所述宿主细胞表达重组蛛丝蛋白;收集所述细胞培养物的包含所述重组蛛丝蛋白的部分;在碱性条件下将所述细胞培养物的所述部分在水溶液中孵育,从而将所述重组蛛丝蛋白增溶在所述水溶液中;调节水溶液至非碱性ph值,从而沉淀所述被增溶的重组蛛丝蛋白;以及从细胞培养物的所述部分中分离出重组蛛丝蛋白,从而产生分离的重组蛛丝蛋白。
30.在另一个方面,本文提供了组合物,其包含通过所公开的方法中的任一种产生的重组蛛丝蛋白。
31.在一些实施方案中,重组蛛丝包含至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%的全长重组蛛丝。
32.在另一个方面,本文提供了丝纤维,其包含通过所公开的方法中的任一种产生的重组蛛丝蛋白。
33.在一些实施方案中,丝纤维包括至少19cn/tex的韧性。
34.在另一个方面,本文提供了组合物,其包含在碱性缓冲液中的细胞培养物,所述细胞培养物包含生长培养基和宿主细胞,所述宿主细胞包含重组蛛丝蛋白。
35.在一个实施方案中,碱性缓冲液的ph值为9至14。在另一个实施方案中,ph值为11至12。
36.在一些实施方案中,蛛丝蛋白为18b或p0。在一些实施方案中,细胞培养物包括真菌细胞、细菌细胞或酵母细胞。在一个实施方案中,细菌细胞为大肠埃希菌细胞。在一个实
press,cold spring harbor,n.y.(1990);taylor和drickamer,introduction to glycobiology,oxford univ.press(2003);worthington enzyme manual,worthington biochemical corp.,freehold,n.j.;handbook of biochemistry:section aproteins,第i卷,crc press(1976);handbook of biochemistry:section a proteins,第ii卷,crc press(1976);essentials of glycobiology,cold spring harbor laboratory press(1999)。
51.本文提到的所有公布、专利和其他参考文献均通过引用以其整体并入本文。
52.以下术语,除非另有规定,否则应被理解为具有以下含义:
53.如本文所用的术语“发酵的”和“发酵”描述了在用于产生期望产物的条件下培养宿主细胞,所述条件包括但不限于宿主细胞生长的条件。
54.如本文所用的术语“发酵肉汤”是指在发酵过程中用于培养宿主细胞的水性培养基。
55.如本文所用的术语“接种物”是指加入到发酵肉汤中以启动发酵的一定量的宿主细胞。
56.如本文所用的术语“净化(clarifying)”是指除去宿主细胞生物质的方法,所述宿主细胞生物质诸如全细胞、裂解的细胞、细胞膜、脂质、细胞器、细胞核、非蛛丝蛋白,或任何其他不需要的细胞部分或产物,或细胞培养物的任何其他不需要的部分。净化也可指从部分纯化或分离的蛛丝组合物中除去杂质。杂质可包括但不限于非蛛丝蛋白、降解的蛛丝蛋白、蛋白质的大聚集体、纯化和分离过程中使用的化学品,或任何其他不合需要的材料。
57.如本文所用的术语“纯度”是指全长的分离的重组蛛丝蛋白在样品(诸如经提取的样品)中所有分离出来的组分中所占的百分比,所述所有分离出来的组分诸如部分或降解的分离的重组蛛丝蛋白、脂质、蛋白质、细胞膜或其他分子。
58.如本文所用的术语“收率”是指从细胞培养物中分离出的全长重组蛛丝蛋白的量相对于对照样品中的全长丝蛋白或总丝蛋白的量的百分比。所述百分比可参照细胞裂解液、粗碱性提取液、部分纯化或过滤的碱性提取液、经受碱性提取方法的纯化溶液或经受对照提取方法(诸如本文所述的尿素或gdscn)的纯化溶液中的全长蛛丝蛋白的总量。
59.术语“多核苷酸”或“核酸分子”是指长度为至少10个碱基的核苷酸的聚合形式。该术语包括dna分子(例如,cdna或基因组dna或合成dna)和rna分子(例如,mrna或合成rna),以及含有非天然核苷酸类似物、非原始核苷间键或两者的dna或rna的类似物。核酸可以呈任何拓扑构象。例如,核酸可以是单链、双链、三链、四链、部分双链、具支链、发夹型、环状或呈挂锁(padlocked)构象。
60.除非另有规定,并且作为本文中以通用格式“seq id no:”描述的所有序列的实例,“包含seq id no:1的核酸”是指这样的核酸,其至少一部分具有以下序列:(i)seq id no:1的序列,或者(ii)与seq id no:1互补的序列。两者之间的选择由上下文决定。例如,如果核酸被用作探针,则两者之间的选择取决于探针与期望靶标互补的要求。
[0061]“分离的”rna、dna或混合聚合物是这样的rna、dna或混合聚合物,其和与其天然宿主细胞中原始多核苷酸天然伴随的其他细胞成分,例如与其天然相关联的核糖体、聚合酶和基因组序列基本分离。
[0062]
术语“重组体”是指这样的生物分子(例如基因或多肽),其:(1)已从其天然存在的
环境中移出,(2)与在自然界中发现该基因的多核苷酸的全部或部分不相关联,(3)与在自然界中未和其连接的多核苷酸可操作地连接,或者(4)在自然界中不存在。术语“重组体”可以针对克隆的dna分离物、化学合成的多核苷酸类似物或由异源系统生物合成的多核苷酸类似物以及由此类核酸编码的多肽和/或mrna使用。
[0063]
如本文所用,如果异源序列与内源核酸序列相邻放置,使得该内源核酸序列的表达发生改变,则生物体基因组中的该内源核酸序列(或该序列的编码多肽产物)在本文中被视为“重组体”。在这种背景下,异源序列是与内源核酸序列天然不相邻的序列,无论该异源序列本身是内源的(源自同一宿主细胞或其后代)还是外源的(源自不同宿主细胞或其后代)。举例来说,对于宿主细胞的基因组中基因的原始启动子而言,启动子序列可以被取代(例如,通过同源重组),使得该基因具有改变的表达模式。该基因现在将变成为“重组体”,因为它和与其自然侧接的序列中的至少一些序列分离。在实施方案中,异源核酸分子不与该生物体同源。在进一步的实施方案中,异源核酸分子是通过同源或随机整合而整合到宿主染体中的质粒或分子。
[0064]
如果核酸含有基因组中的相应核酸中不会天然存在的任何修饰,则该核酸也被视为“重组体”。例如,如果内源编码序列含有人工引入,例如通过人为干预引入的插入、删除或点突变,则该内源编码序列被视为“重组体”。“重组核酸”还包括在异源位点整合到宿主细胞染体中的核酸和作为附加体存在的核酸构建体。
[0065]
在核酸序列的背景下,术语“序列同一性百分比”是指当进行最大对应比对时两个序列中残基比对的定量值。序列同一性比较的长度可能在一段至少约9个核苷酸,通常至少约20个核苷酸,更通常至少约24个核苷酸,通常至少约28个核苷酸,更通常至少约32个核苷酸,并且优选至少约36个或更多个核苷酸上。本领域已知有许多不同的算法可用于测量核苷酸序列同一性。例如,多核苷酸序列可以使用fasta、gap或bestfit进行比较,它们是genetics computer group(gcg),madison,wis的wisconsin package第10.0版中的程序。fasta提供在查询序列和搜索序列之间最佳重叠的区域的比对和序列同一性百分比。pearson,methods enzymol.183:63-98(1990)(在此通过引用的方式整体并入)。例如,核酸序列之间的序列同一性百分比可以使用fasta以其默认参数(字长为6以及评分矩阵为nopam因子)或使用如gcg第6.1版(通过引用的方式并入本文)中提供的gap以其默认参数来确定。或者,可以使用计算机程序blast(altschul等人,j.mol.biol.215:403-410(1990);gish和states,nature genet.3:266-272(1993);madden等人,meth.enzymol.266:131-141(1996);altschul等人,nucleic acids res.25:3389-3402(1997);zhang和madden,genome res.7:649-656(1997)),尤其是blastp或tblastn(altschul等人,nucleic acids res.25:3389-3402(1997))对序列进行比较。
[0066]
当涉及核酸或其片段时,术语“实质同源性”或“实质相似性”表示,当与另一种核酸(或其互补链)的适当核苷酸插入或删除作最佳比对时,根据任何公认的序列同一性算法如前面讨论的fasta、blast或gap所测量,在至少约76%、80%、85%,优选至少约90%,并且更优选至少约95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸碱基上存在核苷酸序列同一性。
[0067]
核酸(也称为多核苷酸)可包括rna、cdna、基因组dna和前述的合成形式以及混合聚合物的有义链与反义链。如本领域技术人员将容易理解的,它们可被化学或生物化学修饰或可含有非天然或衍生的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标记,甲基化,一个或多个天然
存在的核苷酸被类似物置换,核苷酸间修饰如不带电荷的连接键(例如,甲基膦酸酯类、磷酸三酯类、氨基磷酸酯类、氨基甲酸酯类等)、带电荷的连接键(例如,硫代磷酸酯类、二硫代磷酸酯类等)、悬垂部分(例如,多肽类)、嵌入剂(例如,吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷基化剂和经修饰的连接键(例如,α异头核酸等)。还包括了通过氢键和其他化学相互作用模拟多核苷酸结合至指定序列的能力的合成分子。此类分子是本领域已知的,并且包括例如其中肽连接键替代分子主链中的磷酸酯连接键的那些。其他修饰可以包括,例如,其中核糖环含有桥联部分或其他结构的类似物,诸如在“锁定”核酸中发现的修饰。
[0068]
术语“突变的”,当被应用于核酸序列时,是指核酸序列中的核苷酸与参考核酸序列相比可能被插入、删除或改变。可以在基因座进行单一改变(点突变),或者可以在单个基因座处插入、删除或改变多个核苷酸。此外,可以在核酸序列内任何数量的基因座处进行一个或多个改变。核酸序列可以通过本领域已知的任何方法进行突变,包括但不限于诱变技术,例如“易错pcr”(一种在dna聚合酶的复制保真度较低的条件下进行pcr,从而在pcr产物的整个长度上获得高点突变率的过程;参见例如leung等人,technique,1:11-15(1989)和caldwell&joyce,pcr methods applic.2:28-33(1992));以及“寡核苷酸定向诱变”(一种使得位点特异性突变能够在任何感兴趣的克隆dna节段中产生的过程;参见例如,reidhaar-olson and sauer,science241:53-57(1988))。
[0069]
如本文所用,术语“载体”意指这样的核酸分子,其能够运输已与其连接的另一个核酸。一类载体是“质粒”,其通常是指额外的dna节段可连接到其中的环状双链dna环,但也包括线性双链分子,例如通过聚合酶链反应(pcr)扩增或用限制酶处理环状质粒而得到的那些。其他载体包括粘粒、细菌人工染体(bac)和酵母人工染体(yac)。另一类载体是病毒载体,其中额外的dna节段可被连接到病毒基因组中(在下文中更详细地讨论)。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如具有在宿主细胞中起作用的复制起点的载体)。其他载体在引入到宿主细胞后可以被整合到宿主细胞的基因组中,从而与宿主基因组一起被复制。此外,某些优选的载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。
[0070]
如本文所用的术语“表达系统”包括用于使宿主细胞中的基因表达的媒介物或载体以及使基因稳定整合到宿主染体中的媒介物或载体。
[0071]“操作性地连接的(operatively linked)”或“可操作地连接的(operably linked)”表达控制序列是指其中表达控制序列与感兴趣的基因紧邻以控制感兴趣的基因的连接,以及以反式或在一定距离内作用来控制感兴趣的基因的表达控制序列。
[0072]
如本文所用的术语“表达控制序列”是如本文所用指影响与它们可操作地连接的编码序列的表达所必需的多核苷酸序列。表达控制序列是控制核酸序列的转录、转录后事件和翻译的序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列;有效的rna处理信号,例如剪接和聚腺苷酸化信号;稳定细胞质mrna的序列;提高翻译效率的序列(例如,核糖体结合位点);提高多肽稳定性的序列;以及在需要时,提高多肽分泌的序列。此类控制序列的性质根据宿主生物体的不同而不同;在原核生物中,此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“控制序列”旨在至少包括其存在对于表达是必不可少的所有组分,并且还可以包括其存在是有利的另外的组分,例如前导序列和融合伴侣序列。
biomedical applications,cell.mol.life sci.,68:2,第169-184页(2011);以及humenik,m.等人,spider silk:understanding the structure-function relationship of a natural fiber,prog.mol.biol.transl.sci.,103,第131-85页(2011)。例如:
[0084]
葡萄状腺(acsp)丝趋于具有高韧性,这是适当高的强度与适当高的延展性结合的结果。acsp丝的特征在于大嵌段(“整体重复”)尺寸,其常常掺有聚丝氨酸和gpx的基序。管状腺(tusp或圆柱形)丝趋于具有大直径,具有适度的强度和高延展性。tusp丝的特征在于它们的聚丝氨酸和聚苏氨酸含量,以及短束的聚丙氨酸。大壶状腺(masp)丝趋于具有高强度和适度的延展性。masp丝可以是两个亚型:masp1和masp2中的一种。masp1丝的延展性一般比masp2丝小,并且masp1丝的特征在于聚丙氨酸、gx和ggx基序。masp2丝的特征在于聚丙氨酸、ggx和gpx基序。小壶状腺(misp)丝趋于具有适度的强度和适度的延展性。misp丝的特征在于ggx、ga和poly a基序,且往往含有约100个氨基酸的间隔元件。鞭毛腺(flag)丝趋于具有很高的延展性和适度的强度。flag丝的特征通常在于gpg、ggx和短间隔基序。
[0085]
每个丝类型的特性可以因物种的不同而不同,并且具有不同生活方式(例如,定居纺足目(sedentary web spinner)与漫游猎蛛(vagabond hunter))或进化上更古老的蜘蛛可产生特性与前文描述不同的丝(关于蜘蛛多样性和分类的描述,参见hormiga,g.和griswold,c.e.,systematics,phylogeny,and evolution of orb-weaving spiders,annu.rev.entomol.59,第487-512页(2014);以及blackedge,t.a.等人,reconstructing web evolution and spider diversification in the molecular era,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,106:13,第5229-5234页(2009))。然而,与原始丝蛋白的重复结构域具有序列相似性和/或氨基酸组成相似性的合成嵌段共聚物多肽可以用于按商业规模制造重现了相应天然丝纤维的特性的一致的丝状纤维。
[0086]
丝核苷酸和肽序列
[0087]
可以通过在genbank中检索相关术语,例如“蛛丝蛋白(spidroin)”、“丝心蛋白(fibroin)”、“masp”来汇编假定丝序列的列表,并且可以将那些序列与通过独立测序工作获得的另外的序列汇集在一起。然后将序列翻译成氨基酸,过滤重复的条目,并手动拆分成结构域(ntd、rep、ctd)。在一些实施方案中,候选氨基酸序列被反向翻译成经优化用于例如在巴斯德毕氏酵母(巴斯德驹形氏酵母(komagataella pastoris))或大肠埃希菌中进行微生物表达的dna序列。将dna序列各自克隆到表达载体中,并转化为微生物,诸如巴斯德毕氏酵母(巴斯德驹形氏酵母)或大肠埃希菌。在一些实施方案中,随后以组合方式组装显示出成功表达与分泌的各种丝结构域,以构建能够形成纤维的丝分子。
[0088]
丝多肽特征性地由侧接于非重复区域(例如,c-末端和n-末端结构域)的重复结构域(rep)组成。重复结构域显示出层次架构。重复结构域包含一系列嵌段(也称为重复单元)。所述嵌段在整个丝重复结构域中是重复的,有时完美重复,有时不完美重复(构成准重复结构域)。嵌段的长度和组成在不同的丝类型之间以及不同的物种之间有所不同。表1列出了来自所选物种和丝类型的嵌段序列的实例,以下文献中给出了进一步的实例:rising,a.等人,spider silk proteins:recent advances in recombinant production,structure-function relationships and biomedical applications,cell mol.life sci.,68:2,第169-184页(2011);以及gatesy,j.等人,extreme diversity,conservation,and convergence of spider silk fibroin sequences,science,291:5513,第2603-2605
页(2001)。在一些情况下,嵌段可以按规则模式排列,形成在丝序列的重复结构域中出现多次(通常2至8次)的较大宏观重复体。重复结构域或宏观重复体内的重复嵌段,以及重复结构域内重复的宏观重复体,可以由间隔元件分开。嵌段序列可包含富含甘氨酸的区域,其后面是poly a区域。短(约1-10个)氨基酸基序可在嵌段内出现多次。图1中描绘了通常观察到的基序的子集。就本发明的目的而言,可以在不参考环状排列的情况下选择来自不同天然丝多肽的嵌段(即,丝多肽之间的鉴定出的其他方面相似的嵌段可能因环状排列而不能对准)。因此,例如,就本发明的目的而言,sgagg的“嵌段”与gsgag相同,并且与gggsa相同;它们全部仅是彼此的环状排列。针对给定丝序列选择的特定排列可能尤其由方便性(通常以g开始)决定。从ncbi数据库获得的丝序列可以划分为嵌段和非重复区域。
[0089]
表1:嵌段序列的样本
[0090]
[0091]
[0092]
[0093]
[0094][0095]
根据本发明某些实施方案的来自嵌段和/或宏观重复结构域的成纤嵌段共聚物多肽在国际公布第wo/2015/042164号(通过引用的方式并入)中有描述。按照结构域(n-末端结构域、重复结构域和c-末端结构域)对从蛋白质数据库(例如genbank)或通过从头测序得到的天然丝序列进行解散。选择用于合成并且组装成纤维的n-末端结构域和c-末端结构域序列包括天然氨基酸序列信息和本文所述的其他修饰。重复结构域被分解成重复序列,该重复序列含有代表性的嵌段,该嵌段根据丝的类型,通常为1至8个,该嵌段捕获关键的氨基酸信息,同时将编码氨基酸的dna的尺寸减小成容易合成的片段。在一些实施方案中,适当形成的嵌段共聚物多肽包含至少一个含有至少1个重复序列的重复结构域,并且任选地侧接n-末端结构域和/或c-末端结构域。
[0096]
在一些实施方案中,重复结构域包含至少一个重复序列。在一些实施方案中,重复序列是150至300个氨基酸残基。在一些实施方案中,重复序列包含多个嵌段。在一些实施方案中,重复序列包含多个宏观重复体。在一些实施方案中,嵌段或宏观重复体被分割到多个重复序列中。
[0097]
在一些实施方案中,重复序列以甘氨酸开始,并且不能以苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、氨酸(w)、半胱氨酸(c)、组氨酸(h)、门冬酰胺(n)、甲硫氨酸(m)或门冬氨酸(d)结束,以满足dna组装要求。在一些实施方案中,重复序列中的一些与原始序列相比可以改变。在一些实施方案中,可以例如通过向多肽的c-末端添加丝氨酸(以避免终止于f、y、w、c、h、n、m或d)来改变重复序列。在一些实施方案中,可通过在不完全嵌段中填充来自另一个嵌段的同源序列来修饰重复序列。在一些实施方案中,可通过重排嵌段或宏观重复体的顺序来修饰重复序列。
[0098]
在一些实施方案中,可以选择非重复性n-末端结构域和c-末端结构域用于合成。在一些实施方案中,n-末端结构域可以是通过去除例如,如通过signalp(peterson,t.n.等人,signalp 4.0:discriminating signal peptides from transmembrane regions,nat.methods,8:10,第785-786页(2011)鉴定的前导信号序列。
[0099]
在一些实施方案中,n-末端结构域、重复序列或c-末端结构域序列可以来自漏斗网蜘蛛(agelenopsis aperta)、aliatypus gulosus、哥斯大黎加斑马脚(aphonopelma seemanni)、短牙蛛某些种(aptostichus sp.as217)、短牙蛛某些种(aptostichus sp.as220)、十字园蛛(araneus diadematus)、猫脸蜘蛛(araneus gemmoides)、大腹圆蛛(araneus ventricosus)、悦目金蛛(argiope amoena)、银金蛛(argiope argentata)、横纹金蛛(argiope bruennichi)、三带金蛛(argiope trifasciata)、atypoides riversi、巴西黄斑粉趾(avicularia juruensis)、加州陷门蛛(bothriocyrtum californicum)、巨眼蛛(deinopis spinosa)、灰迪格蛛(diguetia canities)、黑捕鱼蛛(dolomedes tenebrosus)、euagrus chisoseus、苗圃网络蜘蛛(euprosthenops australis)、乳突棘旗蛛(gasteracantha mammosa)、hypochilus thorelli、kukulcania hibernalis、黑寡妇蜘蛛(latrodectus hesperus)、megahexura fulva、metepeira grandiosa、金圆网蛛(nephila antipodiana)、棒络新妇(nephila clavata)、络新妇蛛(nephila clavipes)、马达加斯加新妇(nephila madagascariensis)、斑络新妇(nephila pilipes)、近络新妇属蛛(nephilengys cruentata)、帕拉威夏双条纹蛛(parawixia bistriata)、绿猞猁蜘蛛(peucetia viridans)、原始肉食蛛(plectreurys tristis)、印度华丽雨林蛛(poecilotheria regalis)、长爪绿突光蝴蛛(tetragnatha kauaiensis)或全异妩蛛(uloborus diversus)。
[0100]
在一些实施方案中,丝多肽核苷酸编码序列可以与α交配因子核苷酸编码序列操作性地连接。在一些实施方案中,丝多肽核苷酸编码序列可以与另一种内源或异源分泌信号编码序列操作性地连接。在一些实施方案中,丝多肽核苷酸编码序列可以与3x flag核苷酸编码序列操作性地连接。在一些实施方案中,丝多肽核苷酸编码序列与其他亲和标记诸如6至8个his残基操作性地连接。
[0101]
分泌信号
[0102]
从细胞分泌的蛋白质的量在各蛋白质间明显不同,并且部分依赖于分泌信号,所述分泌信号可操作地连接于其新生状态的蛋白质。许多分泌信号是本领域已知的,有些信号常用于生产分泌的重组蛋白,包括巴斯德毕氏酵母和酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)的微生物分泌信号。这些中突出的是酿酒酵母的α-交配因子(αmf)的分泌信号,其由n-末端19个氨基酸的信号肽(本文中也称为pre-αmf(sc)),随后为70个氨基酸的前
导肽(本文中也称为pro-αmf(sc))组成。酿酒酵母的αmf的分泌信号中pro-αmf(sc)的纳入(本文中也称为pre-αmf(sc)/pro-αmf(sc))已被证明对实现蛋白质的高分泌收率至关重要。向除pre-αmf(sc)以外的信号肽中添加pro-αmf(sc)或其功能变体也已经作为实现重组蛋白分泌的手段而被探索,但显示出不同程度的有效性,增加某些重组宿主细胞中某些重组蛋白的分泌,但对其他重组蛋白无影响或减少其他重组蛋白的分泌。
[0103]
如美国申请15/724,196中所述,使用多种不同的分泌信号可以改善宿主细胞(诸如巴斯德毕氏酵母)中产生的重组蛋白的分泌收率。与包含多个编码仅与一个分泌信号(例如,pre-αmf(sc)/pro-αmf(sc))可操作地连接的重组蛋白的多核苷酸序列的重组宿主细胞相比,包含相同数量的编码与至少2个不同分泌信号可操作地连接的重组蛋白的多核苷酸序列的重组宿主细胞产生较高的重组蛋白分泌收率。不希望受理论束缚,使用至少2种不同的分泌信号可能允许重组宿主细胞参与不同的细胞分泌途径以实现重组蛋白的有效分泌,从而防止任何一种分泌途径过饱和。
[0104]
至少一个不同的分泌信号包括可从表2或表3选择的信号肽,或者是与选自表2或3的信号肽有至少80%氨基酸序列同一性的功能变体。在一些实施方案中,功能变体是选自表2或3的信号肽,其包含一个或两个取代的氨基酸。在一些此类实施方案中,功能变体与选自表2或3的信号肽有至少85%、至少90%、至少95%或至少99%的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中,信号肽在翻译后介导新生重组蛋白易位至er中(即,蛋白质合成先于易位,使得新生重组蛋白在易位至er中之前就存在于细胞质中)。在其他实施方案中,信号肽在共翻译时介导新生重组蛋白易位至er中(即,蛋白质合成和易位至er中同时发生)。使用介导向er中的共翻译易位的信号肽的优点是防止容易快速折叠的重组蛋白呈现阻碍易位至er中并从而阻碍分泌的构象。
[0105]
表2-分泌信号
[0106][0107]
表3-重组分泌信号
[0108][0109][0110]
表达载体
[0111]
本发明的表达载体可以结合本领域已知的技术根据本说明书的教示内容生产。序列(例如载体序列或编码转基因的序列)可从诸如integrated dna technologies,coralville,ia或atum,menlo park,ca的公司商购。本文中举例说明了指导嵌合丝多肽的高水平表达的表达载体。
[0112]
本发明中使用的多核苷酸的另一个标准来源是从生物体(例如,细菌)、细胞或所选组织中分离出的多核苷酸。来自所选来源的核酸可通过标准程序分离,所述标准程序通常包括连续的苯酚和苯酚/氯仿提取,接着为乙醇沉淀。沉淀后,可用限制性内切核酸酶处理多核苷酸,该酶将核酸分子裂解成片段。所选尺寸的片段可通过包括琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或脉冲场凝胶电泳(care等人(1984)nuc.acid res.12:5647-5664;chu等人(1986)science 234:1582;smith等人(1987)methods in enzymology 151:461)在内的多种技术进行分离,以提供适当尺寸的起始物料用于克隆。
[0113]
另一种获取表达载体或构建体的核苷酸组分的方法是pcr。macpherson等人在pcr:a practical approach,(irl press at oxford university press,(1991))中教示了pcr的一般程序。每个应用反应的pcr条件可通过经验确定。许多参数影响反应的成功。这
些参数当中有退火温度和时间,延伸时间(extension time),mg2+和atp浓度,ph值以及引物、模板和脱氧核糖核酸酶的相对浓度。下面在实施例中描述了示例性引物。在扩增后,由此得到的片段可先用琼脂糖凝胶电泳,接着用溴化乙锭染和紫外照射显影进行检测。
[0114]
另一种获取多核苷酸的方法是通过酶消化。例如,核苷酸序列可用适宜的识别限制性内切酶消化适当的载体来生成。限制性裂解的片段可通过使用标准技术,在四种脱氧核苷酸三磷酸(dntp)存在下用大肠埃希菌dna聚合酶i(klenow)的大片段处理来钝端化(blunt ended)。
[0115]
使用本领域众所周知的方法将多核苷酸插入适宜的骨架,例如,质粒中。例如,插入片段和载体dna可在适宜的条件下与限制性内切酶接触,以在每个分子上产生可以彼此配对并可用连接酶接合的互补端或钝端。替代地,合成核酸接头可连接至多核苷酸的末端。这些合成接头可含有对应于载体dna中特定限制位点的核酸序列。其他手段是本领域已知和可用的。组分多核苷酸可以使用多种来源。
[0116]
在一些实施方案中,将含有r、n或c序列的表达载体转化至宿主生物体中用于表达和分泌。在一些实施方案中,表达载体包含分泌信号。在一些实施方案中,表达载体包含终止子信号。在一些实施方案中,表达载体被设计为整合到宿主细胞基因组中,并且包含:靶基因组的同源区域、启动子、分泌信号、标签(例如,flag标签)、终止/polya信号、毕氏酵母的可选择标记物、大肠埃希菌的可选择标记物、大肠埃希菌的复制起点以及用于释放感兴趣的片段的限制位点。
[0117]
宿主细胞转化体
[0118]
提供了用核酸分子或表达蛛丝多肽的载体转化的宿主细胞及其后代。这些细胞还可以在载体上携带本发明的核酸序列,所述载体可以是但不必是自由复制的载体。在本发明的其他实施方案中,核酸已被整合到宿主细胞的基因组中。
[0119]
在一些实施方案中,能够大规模产生本发明嵌段共聚物多肽的微生物或宿主细胞包括以下的组合:1)产生大(》40kda)多肽的能力;2)在细胞外分泌多肽并规避昂贵的下游细胞内纯化的能力;3)大规模地抵抗污染物(诸如病毒和细菌污染物)的能力;以及/或者4)用于生长和处理生物体的现有技术是大规模(1-2000m3)的生物反应器。
[0120]
多种宿主生物体可以被工程化/转化为包含嵌段共聚物多肽表达系统。用于表达重组丝多肽的优选生物体包括酵母菌、真菌、革兰氏阴性菌和革兰氏阳性细菌。在某些实施方案中,宿主生物体为食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(arxula adeninivorans)、棘孢曲霉(aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(aspergillus awamori)、无花果曲霉(aspergillus ficuum)、烟曲霉(aspergillus fumigatus)、日本曲霉(aspergillus japonicus)、构巢曲霉(aspergillus nidulans)、黑曲霉(aspergillus niger)、米曲霉(aspergillus oryzae)、酱油曲霉(aspergillus sojae)、塔宾曲霉(aspergillus tubigensis)、嗜碱芽孢杆菌(bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)、芽孢杆菌(bacillus anthracis)、短芽孢杆菌(bacillus brevis)、环状芽胞杆菌(bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)、甲醇芽孢杆菌(bacillus methanolicus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)、博伊丁假丝酵
母(candida boidinii)、拉克淖金孢子菌(chrysosporium lucknowense)、大肠埃希菌、禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)、镰孢霉(fusarium venenatum)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、马克思克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、嗜热毁丝霉(myceliopthora thermophila)、粗糙链孢霉(neurospora crassa)、汉逊酵母(ogataea polymorpha)、沙门柏干酪青霉(penicillium camemberti)、变灰青霉(penicilliumcanescens)、产黄青霉(penicillium chrysogenum)、埃默森青霉(penicillium emersonii)、绳状青霉(penicillium funiculosum)、灰玫瑰青霉(penicillium griseoroseum)、产紫青霉(penicillium purpurogenum)、娄地青霉(penicillium roqueforti)、白腐真菌(phanerochaete chrysosporium)、安格斯毕氏酵母(pichia angusta)、甲醇毕氏酵母(pichia methanolica)、巴斯德毕氏酵母(巴斯德驹形氏酵母)、多形毕氏酵母(pichia polymorpha)、树干毕氏酵母(pichia stipitis)、米赫根毛霉(rhizomucor miehei)、微小根毛霉(rhizomucor pusillus)、少根根霉(rhizopus arrhizus)、变铅青链霉(streptomyces lividans)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、西方许旺酵母(schwanniomyces occidentalis)、哈茨木霉(trichoderma harzianum)、里氏木霉(trichoderma reesei)或耶氏解脂酵母(yarrowia lipolytica)。
[0121]
在优选的方面,所述方法涉及培养宿主细胞以使其直接分泌产物,以便容易回收而不需要提取生物质。在一些实施方案中,嵌段共聚物多肽被直接分泌到培养基中以进行收集和处理。
[0122]
工程化宿主细胞系
[0123]
任何适当的宿主细胞系均可用于生产重组蛋白。甲基营养型酵母巴斯德毕氏酵母被广泛用于重组蛋白的生产。巴斯德毕氏酵母生长至高细胞密度,提供受严格控制的甲醇诱导的转基因表达,并在确定成分培养基(defined media)中高效地分泌异源蛋白质。但是,在巴斯德毕氏酵母菌株的培养过程中,重组表达蛋白可能在其被收集之前被降解,导致产生包含重组表达蛋白质片段的蛋白质混合物以及全长重组蛋白质的收率降低。另一种广泛使用的重组蛋白生产用细胞系是细菌大肠埃希菌。
[0124]
在一些实施方案中,本文所述的具有降低的蛋白酶活性的经修饰菌株重组表达丝状多肽序列。在一些实施方案中,丝状多肽序列是1)通过混合和匹配来源于丝多肽序列的重复结构域而产生的嵌段共聚物多肽组合物,和/或2)由工业可放大的微生物分泌的用于形成有用纤维的具有足够大尺寸(约40kda)的嵌段共聚物多肽的重组表达。由丝重复结构域片段工程改造的大(约40kda至约100kda)嵌段共聚物多肽(包括来自蜘蛛丝多肽的几乎所有公布的氨基酸序列的序列)可以在本文所述的经修饰的微生物中表达。在一些实施方案中,丝多肽序列被匹配并设计用于生产能够形成纤维的高度表达和分泌的多肽。在一些实施方案中,宿主修饰菌株中蛋白酶基因的敲除或蛋白酶活性的降低减少了丝状多肽的降解。
[0125]
在一些实施方案中,为了减弱巴斯德毕氏酵母中的蛋白酶活性,使编码这些酶的基因失活或突变以降低或消除活性。这可以通过对所述基因本身进行突变或插入或者通过对基因调节元件进行修饰来完成。这可以通过标准酵母遗传学技术来实现。此类技术的实例包括通过双重同源重组进行的基因替代,其中将侧接待失活基因的同源区域克隆在侧接可选择标记基因(例如抗生素抗性基因或补充酵母菌株的营养缺陷体的基因)的载体中。
[0126]
替代地,可以对同源区域进行pcr扩增,并将其通过重叠pcr连接至可选择标记基因。随后,通过本领域已知的方法例如电穿孔,将此类dna片段转化为巴斯德毕氏酵母。然后通过标准技术(例如在基因组dna上的pcr或southern印迹),分析在选择性条件下生长的转化子以进行基因破坏事件。在替代实验中,基因失活可以通过单一同源重组来实现,在这种情况下,例如,将所述基因的orf的5'末端克隆在还含有可选择标记基因的无启动子载体上。在通过用仅切割靶基因同源片段中载体的限制酶消化来将此类载体线性化后,此类载体被转化为巴斯德毕氏酵母。通过在基因组dna上的pcr或southern印迹,确认了靶基因位点处的整合。通过这种方式,在基因组中实现载体上克隆的基因片段的复制,生成靶基因基因座的两个拷贝:第一个拷贝,其中orf不完整,从而导致了缩短的无活性蛋白质的表达(如果有表达的话);以及第二个拷贝,其没有用于驱动转录的启动子。
[0127]
替代地,使用转座子诱变来使靶基因失活。可以通过pcr针对靶基因中的插入事件来对此类突变体的文库进行筛选。
[0128]
工程化/敲除菌株的功能性表型(即缺陷)可以使用本领域已知的技术进行评估。例如,工程化菌株在蛋白酶活性方面的缺陷可以使用本领域已知的多种方法中的任一种,例如生蛋白酶底物的水解活性的测定、所选蛋白酶的底物蛋白的谱带位移等来探知。
[0129]
本文所述的蛋白酶活性的减弱可以通过敲除突变以外的机制来实现。例如,期望蛋白酶可通过如下方式经由氨基酸序列变化来减弱:改变核酸序列,将基因置于活性较低的启动子的控制下,向下调节,表达靶向感兴趣的基因的干扰rna、核酶或反义序列,或本领域已知的任何其他技术。在优选的菌株中,在pas_chr4_0584(yps1-1)和pas_chr3_1157(yps1-2)处编码的蛋白酶的蛋白酶活性通过上述方法中的任一种方法来减弱。在一些方面中,本发明涉及甲基营养型酵母菌株,尤其是其中yps1-1和yps1-2基因已失活的巴斯德毕氏酵母菌株。在一些实施方案中,另外的蛋白酶编码基因也可以按照本文中提供的方法敲除,以进一步降低该菌株表达的期望蛋白质产物的蛋白酶活性。
[0130]
在某些实施方案中,本文公开的巴斯德毕氏酵母菌株已被修饰以表达丝状多肽。wo 2015/042164,尤其是第114至134段(通过引用并入本文),提供了生产丝状多肽的优选实施方案的方法。本文公开了基于源自例如来自于物种横纹金蛛(argiope bruennichi)的masp2的重组蛛丝蛋白片段序列的合成蛋白质类共聚物。描述了丝状多肽,其包括两个至二十个重复单元,其中每个重复单元的分子量大于约20kda。在共聚物的每个重复单元内有超过约60个被组织成许多“准重复单元”的氨基酸残基。在一些实施方案中,本公开中描述的多肽的重复单元与masp2拖丝蛋白序列具有至少95%的序列同一性。
[0131]
生产和纯化重组蛋白的方法
[0132]
本文提供的方法包括在合适的发酵条件下,在合适的发酵肉汤和合适的发酵容器中发酵本文提供的重组宿主细胞的接种物,以生产期望累积收率和/或累积滴度和/或累积生产率的重组蛋白。
[0133]
在一些实施方案中,重组宿主细胞分泌重组蛋白。在各种实施方案中,重组宿主细胞可为不分泌重组蛋白的原核生物。在具体实施方案中,重组宿主细胞为大肠埃希菌。
[0134]
在各种实施方案中,重组宿主细胞可为分泌重组蛋白的真核生物或分泌重组蛋白的原核生物,诸如革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。在一些实施方案中,重组宿主细胞为巴斯德毕氏酵母。在具体实施方案中,重组宿主细胞为一种或多种蛋白酶的活性丧失(例
如,通过功能性敲除)的巴斯德毕氏酵母菌株。此外,下面讨论的特定实施方案适合于生产重组疏水性或部分疏水性蛋白,诸如丝蛋白。
[0135]
通过引用并入本文的美国专利9,963,554,“methods and compositions for synthesizing improved silk fibers”公开了合成嵌段共聚物的组合物、用于它们的生产的重组微生物以及包含所述蛋白质的合成纤维。通过引用并入本文的美国专利申请15/724,196,“modified strains for the production of recombinant silk”公开了被选择为或被基因工程化为减少由酵母细胞表达的重组蛋白的降解的工程化巴斯德毕氏酵母细胞,以及培养酵母细胞用于生产有用的化合物的方法。可以培养包括大肠埃希菌在内的其他适当的微生物菌株并将其用于生产有用的化合物。
[0136]
发酵
[0137]
在一些实施方案中,重组宿主细胞的接种物可以源自种子菌株(即一系列用于产生适当数量的重组宿主细胞的体积不断增大的发酵物)。根据该实施方案,种子的数量范围可为2-7、3-7、3-6或3-5个种子。
[0138]
在一些实施方案中,重组宿主细胞的接种物每升培养基的干细胞重量(dcw)为至少0.2g/l、至少0.5g/l、至少0.7g/l、至少0.8g/l、至少1g/l、至少2g/l、至少3g/l、至少4g/l或至少5g/l;在0.2g/l和3g/l之间、0.2g/l和2g/l之间或0.2g/l和1g/l之间;在0.5g/l和3g/l之间、0.5g/l和2g/l之间或0.5g/l和1g/l之间;在1g/l和3g/l之间、1g/l和2g/l之间或0.5g/l和1g/l之间;或在3g/l和1g/l之间。dcw可用生物光度计(例如,eppendorf bio photometer d30)测定。
[0139]
在大多数实施方案中,接种物的量将取决于发酵容器的尺寸。在发酵容器尺寸小于150l的实施方案中,dcw可在0.1g/l-0.5g/l的范围内。在发酵容器尺寸大于150l的实施方案中,dcw可在2-4g/l的范围内。
[0140]
根据具体实施方案,合适的发酵肉汤是其中重组宿主细胞可以生存(即维持生长和/或活力)的任何发酵肉汤。合适的发酵肉汤的非限制性实例包括包含重组宿主细胞的生长和/或活力所需的营养物的水性培养基。此类营养物的非限制性实例包括碳源、氮源、磷酸盐源、盐类、矿物质、碱、酸、维生素(例如,生物素)、氨基酸和金属(例如,铁、锌、钙、铜、钠、钾、钴、镁、锰)。
[0141]
在一些实施方案中,可以限制以上营养物中的任一种以抑制细胞生长并改善重组蛋白的生产率、收率或滴度。碳源可为能够被重组宿主细胞发酵的任何碳源。合适的碳源的非限制性实例包括单糖、二糖、多糖、醋酸盐、乙醇、甲醇、甲烷及其组合。单糖的非限制性实例包括右旋糖(葡萄糖)、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖及其组合。二糖的非限制性实例包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖及其组合。多糖的非限制性实例包括淀粉、糖原、纤维素及其组合。
[0142]
氮源可为能够被重组宿主细胞同化(即,代谢)的任何氮源。合适的氮源的非限制性实例包括富含空气或氧气的无水氨、硫酸铵、硝酸铵、磷酸二铵、磷酸一铵、多聚磷酸铵、硝酸钠、尿素、蛋白胨、蛋白水解物、酵母提取物和以上任一种。
[0143]
在一些实施方案中,任何或所有营养物在添加到发酵肉汤中之前,都可利用热量或臭氧化进行灭菌,目的是减少或消除微生物污染。例如,碳源可在添加到发酵肉汤中之前用热量进行焦糖化或灭菌。类似地,碳源可在添加到发酵肉汤中之前进行臭氧化。dziugan
等人“ozonation as an effective way to stabilize new kinds of fermentation media used in biotechnological production of liquid fuel additives,biotechnology for biofuels,9:150(2016)”中讨论了臭氧化的合适方法。
[0144]
发酵肉汤可包含酸或碱以调节和/或维持ph值。在一些此类实施方案中,ph值在4.0和8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0或4.5之间;在4.5和8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5或5.0之间;在5.0和8.0、7.5、7.0、6.5、6.0或5.5之间;在5.5和8.0、7.5、7.0、6.5或6.0之间;在6.0和8.0、7.5、7.0或6.5之间;在6.5和8.0、7.5或7.0之间;在7.0和8.0或7.5之间;或在7.5和8.0之间。
[0145]
合适的酸的非限制性实例包括门冬氨酸、醋酸、盐酸和硫酸。合适的碱的非限制性实例包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铵、碳酸钙、氨和磷酸二铵。在一些实施方案中,使用强酸或强碱限制发酵肉汤的稀释。
[0146]
在一些实施方案中,发酵肉汤包含使期望摄氧速率(our)得以达到和/或维持的此类营养物或此类量的此类营养物。在一些此类实施方案中,期望our为至少40mmol o2/l/hr、至少80mmol o2/l/hr、至少100mmol o2/l/hr、至少105mmol o2/l/h、至少110mmol o2/l/h、至少115mmol o2/l/h、至少120mmol o2/l/hr,or at least 140mmol o2/l/hr、至少160mmol o2/l/hr、至少180mmol o2/l/hr、至少200mmol o2/l/hr或至少220mmol o2/l/hr;在40mmol o2/l/hr和220mmol o2/l/hr之间、60mmol o2/l/hr和220mmol o2/l/hr之间、80mmol o2/l/hr和220mmol o2/l/hr之间或100mmol o2/l/hr和220mmol o2/l/hr之间;在100mmol o2/l/hr和140mmol o2/l/hr之间、100mmol o2/l/hr和135mmol o2/l/hr之间、100mmol o2/l/hr和130mmol o2/l/hr之间或100mmol o2/l/hr和125mmol o2/l/hr之间;在110mmol o2/l/hr和125mmol o2/l/hr之间或110mmol o2/l/hr和120mmol o2/l/hr之间;或在115mmol o2/l/hr和120mmol o2/l/hr之间。our可由本领域的普通技术人员利用bioreaction engineering principles第3版,2011,spring science+business media,第449页中描述的直接法进行计算。
[0147]
在一些实施方案中,发酵肉汤包含使重组宿主细胞的重组蛋白产量相对于副产物的产量增加的此类营养物或此类量的营养物。此类副产物的非限制性实例包括乙醇。在一些实施方案中,在72小时的发酵中,重组宿主细胞产生乙醇的累积收率低于0.1g/l、低于1g/l、低于5g/l、低于10g/l或低于15g/l;在0.1g/l和15g/l之间、1g/l和15g/l之间、5g/l和15g/l之间、10g/l和15g/l之间或0.5g/l和15g/l之间;或在0.1g/l和1.5g/l之间、0.2g/l和1.5g/l之间、0.5g/l和1.5g/l之间、0.7g/l和1.5g/l之间或1.0g/l和之间1.5g/l之间。
[0148]
在一些实施方案中,发酵肉汤包含使期望溶氧(do)含量得以达到和/或维持的此类营养物或此类量的此类营养物。在一些此类实施方案中,期望do含量为至少2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或100%;或在2%和40%之间、2%和5%之间、5%和40%之间、2%和20%之间、5%和20%之间、2和15%之间或5%和15%之间。
[0149]
在一些实施方案中,发酵肉汤包含使期望呼吸商(rq;即,产生的二氧化碳与消耗的氧气的比率)得以达到和/或维持的此类营养物或此类量的此类营养物。在一些此类实施方案中,期望rq为低于2、低于1.75、低于1.5或低于1.25;或在1和1.1之间、1和1.2之间、1和1.3之间、1和1.4之间或1和1.5之间。
[0150]
在一些实施方案中,发酵肉汤包含使期望的重组宿主细胞倍增时间得以达到和/
或维持的此类营养物或此类量的此类营养物。在某些此类实施方案中,期望的倍增时间为至少4小时、8小时、12小时、16小时、18小时、22小时、26小时、30小时、34小时或36小时;或者在4小时和12小时之间、4小时和10小时之间、4小时和8小时之间、6小时和12小时之间、6小时和10小时之间或6小时和8小时之间。
[0151]
在一些实施方案中,发酵肉汤包含一种或多种补充蛋白质。在重组宿主细胞分泌重组蛋白的实施方案中,此类补充蛋白的添加可起到使蛋白酶活性从重组宿主细胞产生的重组蛋白上转移出去的作用。补充蛋白质的非限制性实例包括:牛血清白蛋白(bsa)和酪蛋氨基酸。其他补充蛋白质为本领域众所周知。
[0152]
营养物可以一次大剂量、递增地或连续地添加到发酵肉汤中。在连续添加营养物的实施方案中,它们可以按快、慢或指数速度添加。
[0153]
在向发酵肉汤中连续添加营养物的实施方案中,可以通过连续添加含有营养物的培养基来添加营养物。在这些实施方案中,可将等体积的来自发酵肉汤的水性培养基从发酵物中除去,以使发酵肉汤的总体积保持不变。在一些实施方案中,可将重组宿主细胞从发酵肉汤中移出,并重新添加到含有所述营养物的培养基中,之后添加到发酵肉汤中。
[0154]
合适的发酵容器是其中重组宿主细胞可以生存(维持生长和/或活力)的任何发酵容器。合适的发酵容器的非限制性实例包括培养板、小瓶、烧瓶或发酵罐。合适的发酵罐的非限制性实例包括搅拌釜发酵罐、气升式发酵罐、鼓泡塔反应器、固定床生物反应器及其任何组合。
[0155]
合适的发酵条件是重组宿主细胞可以生存(维持生长和/或活力)的任何条件。此类发酵条件的非限制性实例包括发酵肉汤的合适体积、发酵肉汤的合适ph值、发酵肉汤中合适的do、合适的温度、合适的氧合、合适的重组宿主细胞搅动和合适的发酵持续时间。
[0156]
在各种实施方案中,合适的温度可为适合于重组宿主细胞的生长和/或活力以及/或者重组蛋白生产的任何温度。在一些实施方案中,所述温度为至少15℃、20℃、25℃、30℃、35℃;在15℃至35℃之间、15℃至25℃之间、15℃至20℃之间、20℃至35℃之间、20℃至30℃之间、20℃至25℃之间、25℃至35℃之间或25℃至30℃之间。
[0157]
合适的氧合可为适合于重组宿主细胞的生长和/或活力以及/或重组宿主细胞生产的任何氧合。此类氧合可通过为发酵容器和/或发酵肉汤提供合适的曝气(aeration)和/或合适的搅拌来实现。在一些实施方案中,所述合适的曝气为至少1.5vvm、至少1.6vvm、至少1.7vvm、至少1.8vvm、至少1.9vvm或至少2vvm;在1.5vvm和2vvm之间、1.5vvm和1.9vvm之间、1.5vvm和1.8vvm之间、1.5vvm和1.7vvm之间、1.5vvm和1.6vvm之间、1.6vm和2vvm之间、1.7vvm和2vvm之间、1.8vvm和2vvm之间或1.7vvm和1.9vvm之间。
[0158]
根据实施方案和发酵类型,发酵肉汤中重组宿主蛋白的合适搅拌可以改变。
[0159]
根据实施方案,可使用鼓泡塔进行曝气。鼓泡塔的复杂性可基于具体实施方案而改变(例如,可为单相或多相),并且可以提供各种气体速度。合适的气体速度的非限制性实例包括但不限于0.003-0.08m/s。鼓泡式反应器的非限制性实例参见kantarci等人“bubble column reactors,process biochemistry 40:2263

2283(2005)”。
[0160]
在一些实施方案中,发酵肉汤包含用于在发酵过程中减少泡沫的剂(“消泡剂”)。如本文所定义的泡沫是气体在位于发酵容器顶部或顶部附近的连续液相中的分散体。根据实施方案,消泡剂可被选择并优化为减少与任何重组蛋白产物的相互作用。消泡剂的非限
制性实例包括基于硅的油、乳液和聚合物;聚丙二醇;基于聚乙二醇的消泡剂;基于聚亚烷基二醇的消泡剂;二官能环氧乙烷/环氧丙烷(eo/po)嵌段共聚物;基于脂肪酸的消泡剂;基于聚酯的消泡剂、基于油的消泡剂以及前述的任何组合。junker“foam and its mitigation in fermentation systems,biotechnol.prog.,23:767-784(2007)”中讨论了合适的消泡剂。在重组蛋白为疏水性蛋白质(诸如丝蛋白)的实施方案中,消泡剂可被选择为使得它增溶或不增溶疏水性蛋白质。
[0161]
重组蛋白的期望累积收率可为促成低生产成本的任何累积收率。如本文所用,累积收率计算为生产的重组蛋白的质量占发酵过程中重组宿主细胞代谢的碳源质量的百分比(即,提供的碳源质量减去发酵肉汤中剩余的碳源质量;例如,如果向重组宿主细胞中提供100克葡萄糖,并且在发酵结束时生产了25克重组蛋白,并剩余10克葡萄糖,则重组蛋白的累积收率为27.7%)。假定所有其他指标相等,则较高的累积收率与较低的累积收率相比提供较低的生产成本。在一些实施方案中,发酵72小时后按碳源计重组丝蛋白的累积收率为至少1%、至少5%、至少30%或至少100%;在1%和5%之间、5%和10%之间、10%和35%之间、35%和50%之间或50%和100%之间。
[0162]
重组蛋白的期望累积滴度可为促成低生产成本的任何累积滴度。如本文所用的累积滴度计算为发酵过程中每升发酵肉汤生产的重组蛋白克数(即,g/l)。假定所有其他指标相等,则较高的累积滴度与较低的累积滴度相比提供较低的生产成本。在一些实施方案中,发酵72小时后重组蛋白的累积滴度为至少2g/l、至少5g/l、至少15g/l或至少30g/l;在1g/l和100g/l、5g/l、15g/l或30g/l之间;在10g/l和100g/l、80g/l或75g/l之间;或在5g/l和30g/l之间。
[0163]
重组蛋白的期望累积生产率可为促成低生产成本的任何累积生产率。如本文所用,累积生产率计算为发酵过程中每小时每升发酵肉汤生产的重组蛋白克数(即,g/l/hr)。假定所有其他指标相等,则较高的累积生产率与较低的累积生产率相比提供较低的生产成本。在一些实施方案中,重组蛋白的累积生产率为至少0.001g/l/hr、至少0.025g/l/hr、至少0.05g/l/hr、至少0.1g/l/hr或至少0.2g/l/hr;在0.001g/l/hr和0.5g/l/hr之间。
[0164]
本文提供的方法可在任何发酵规模和/或根据本领域已知的任何发酵程序执行。发酵程序可为分批进料、分批、连续或其任何组合。在一些实施方案中,所述方法从一个或多个分批发酵开始,随后进行一个或多个连续发酵,其中重组宿主细胞的接种物、合适的发酵肉汤、合适的发酵容器和/或一个或多个合适的发酵条件在一个或多个分批发酵和/或一个或多个连续发酵之间可能不同。在一些实施方案中,分批发酵的温度高于连续发酵的温度。在一些此类实施方案中,分批发酵的温度高于27℃,而连续发酵的温度低于27℃。
[0165]
在一些实施方案中,发酵为分阶段进行。此类阶段可包括生长阶段、生产阶段和/或回收阶段。在一些实施方案中,各阶段在重组宿主细胞的接种物、合适的发酵肉汤、合适的发酵容器和/或一个或多个合适的发酵条件方面彼此不同。
[0166]
分离重组蛋白的方法
[0167]
根据实施方案,可使用各种方法分离和回收感兴趣的重组蛋白。如以上所讨论,这些方法中的一些而不是全部特定于分泌感兴趣的重组蛋白的重组宿主细胞。此外,这些方法中一些方法特定于疏水性的感兴趣重组蛋白。
[0168]
图1描绘了根据本发明的一个实施方案的分离重组蛋白的工艺流程。本领域的技
术人员将理解,图1中所示的一些步骤可以交替顺序和/或重复执行。本领域的技术人员将认识到,所公开的实施方案并不打算限制本文所提供方法的范围,并且所述方法可以基于所使用的重组宿主细胞、期望累积收率、累积滴度和/或累积生产率或其他因素而变化。
[0169]
在可选步骤a02中,从包含重组宿主细胞的发酵物中除去生物质(即完整或被破坏的重组宿主细胞和细胞碎片)。在各种实施方案中,除去生物质还可以包括除去不溶性发酵杂质(诸如,例如,消泡剂和蛋白质增溶过程中可能已沉淀的其他发酵肉汤组分)。
[0170]
在各种实施方案中,除去生物质可基于尺寸、重量、密度或其组合而完成。基于尺寸除去生物质可使用例如压滤机、烛式过滤机或其他工业上使用的分子量截留值小于重组宿主细胞尺寸的过滤系统通过过滤来完成。基于重量或密度除去生物质可使用例如沉降器、低g力倾析式离心机、碟片分离器(disk stack separator)、2相喷嘴离心机、固体喷射离心机或旋液分离器通过重力沉降或离心来完成。如本文所公开的除去生物质产生包含蛋白质的离心液(即,轻相或透明的细胞肉汤)和包含生物质及不溶性发酵杂质的固体(重相)。可使用本领域已知的方法来确定用于除去生物质的合适条件(例如,g-力、沉降时间、离心时间、离心机输入物中的固体%、离心机进料速率),旨在尽可能减少透明细胞肉汤中的生物质和不溶性发酵杂质。在一些实施方案中,除去生物质提供了湿填充固体体积低于5%、低于1%、低于0.5%或低于0.1%的透明细胞肉汤。在一些实施方案中,除去生物质提供了包含蛋白质的浓度在1g/l和50g/l之间的透明细胞肉汤。在一些实施方案中,使透明细胞肉汤经受精密(polishing)离心以除去剩余固体。在一些实施方案中,使由除去生物质获得的固体再经受至少一轮的蛋白质增溶和生物质去除,其中最终合并所有离心液以根据本文提供的方法进行进一步处理。
[0171]
根据实施方案,步骤a02可在步骤a04之前和/或之后执行。步骤a02可执行数次。例如,可在步骤a04之前和/或之后执行数轮离心和/或过滤以除去生物质。
[0172]
在步骤a04中,对重组蛋白质增溶。在一些未执行步骤a02的实施方案中,重组蛋白可在增溶前与重组宿主细胞一起分离,方法是将重组宿主细胞和与重组宿主细胞相关联的重组蛋白离心成生物质团块(以下简称“细胞团块”)并弃去上清液。这个步骤在重组蛋白不能溶解和/或与自身和/或重组宿主细胞聚集和/或粘附至重组宿主细胞表面上的情况下可能是有益的。在其他实施方案中,在全细胞肉汤中增溶重组蛋白。在一些实施方案中,将重组蛋白增溶在通过执行步骤a02产生的透明细胞肉汤中。
[0173]
在一些实施方案中,增溶重组蛋白可通过添加增溶剂至全细胞肉汤、透明细胞肉汤或细胞团块中来完成。合适的增溶剂的非限制性实例包括表面活性剂、助水溶物、sds、尿素、半胱氨酸、硫氰酸胍、水解多糖的酶(例如,葡聚糖酶、溶细胞酶、甘露糖酶、甲壳酶)、高ph值水(ph值为11-12的h2o),或其他已知离液剂。不同类型的重组蛋白可选择不同的增溶剂。增溶蛋白质的合适条件(例如,提取剂的类型和量、温度、孵育时间、搅拌和ph值)可使用本领域已知的方法来确定,旨在使重组蛋白的收率最大化并使重组宿主细胞的裂解和杂质的增溶最小化。如上所讨论,在重组蛋白不能溶解和/或与自身聚集和/或聚集在重组宿主细胞中或附近的特定实施方案中,可对重组宿主细胞进行离心并且可丢弃上清液,然后才将增溶剂添加至团块中。
[0174]
在一些实施方案中,可使用各种技术对重组宿主细胞的细胞膜进行穿孔或透化,以便在增溶和/或沉淀之前从细胞膜中除去过量的蛋白质。此类方法包括化学破坏、机械破
坏或超声。细胞膜的机械破坏包括匀质化、剪切力、冷冻/解冻、加热、加压、超声和过滤。化学破坏包括洗涤剂(诸如triton、十二烷基硫酸钠)或离液剂(诸如尿素和胍)。其他方法为本领域众所周知。
[0175]
在具体实施方案中,使用尿素作为增溶剂来增溶重组蛋白并防止破坏重组宿主细胞。可以改变尿素浓度以防止重组宿主细胞被破坏。根据实施方案,尿素浓度的量可在4m至10m的范围内。在各种实施方案中,可将重组宿主细胞和重组蛋白与尿素一起孵育1-2小时、1-3小时或1-4小时。根据实施方案,使用其他已知的离液剂诸如硫氰酸胍来增溶重组蛋白。
[0176]
在具体实施方案中,使用高ph值h2o或水性缓冲液增溶重组蛋白并防止破坏重组宿主细胞。可以改变高ph值h2o或水性缓冲液的ph值以防止重组宿主细胞被破坏。根据实施方案,高ph值h2o的ph值范围可为ph 10至ph 12.5、ph 10.5至ph 12.5、ph 11至ph 12.5、ph 11.5至ph 12.5、ph 12至ph 12.5、ph 10至ph 12、ph 10.5至ph 11.0、ph 10.5至ph 11.5、ph 10.5至ph 12、ph 10.5至ph 12.5、ph 11至ph 11.5,ph 11至ph 12、ph 11.5至ph 12.5或ph 12至ph12.5。在各种实施方案中,可将重组宿主细胞和重组蛋白与高ph值h2o一起孵育至少10分钟、至少15分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少60分钟、至少75分钟、至少90分钟、至少115分钟或至少120分钟。
[0177]
在具体实施方案中,使用匀质化来裂解宿主细胞。匀质化压力(psi)可在5,000-100,000psi之间、5,000-10,000psi之间、10,000-20,000psi之间、20,000-30,000psi之间、30,000-40,000psi之间、40,000-50,000psi之间、50,000-60,000psi之间、60,000-70,000psi之间、70,000-80,000psi之间、80,000-90,000psi之间、90,000-100,000psi之间。匀质化可为单次通过或多次通过。在一些实施方案中,匀质化为一次通过、两次通过、三次通过、四次通过或五次通过。
[0178]
在步骤a06中,从发酵物中除去杂质。步骤a06可在步骤a04和/或步骤a08之前和/或之后执行。步骤a06可重复任何次数。从发酵物中除去杂质可通过过滤、吸收(absorption)(例如炭吸收或固态吸收)、透析和通过凝聚或使用各种化学品诱导的相分离来完成。在通过凝聚诱导相分离的实施方案中,可通过将发酵物冷却至足以诱导相分离的温度来诱导凝聚。在其他实施方案中,可通过添加结构制造剂(cosmotrope)和/或用于使蛋白质从溶液中沉淀出来的化合物来化学诱导相分离。下面针对图c描述了使用相分离去除杂质的详细实施方案。在其中重组蛋白具有热稳定性的一些实施方案中,其他蛋白质可通过使发酵物经受高温以使其他蛋白质变性并离心以使变性的蛋白与溶液中的蛋白质分离来除去。
[0179]
在一些实施方案中,使用过滤、微量过滤、透析过滤和/或超滤(例如,针对去离子水)除去杂质。适合于微量过滤的膜可包括0.1um至1um。合适的超滤用膜的非限制性实例包括具有以下分子量截留值的疏水性膜(例如,pes、ps、醋酸纤维素):在50kda和800kda之间、100kda和800kda之间、200kda和800kda之间、300kda和800kda之间、400kda和800kda之间、500kda和800kda之间、600kda和800kda之间,700kda和800kda之间、100kda和700kda之间、200kda和700kda之间、300kda和700kda之间、400kda和700kda之间、500kda和700kda之间、600kda和700kda之间或500kda和600kda之间。在一些实施方案中,超滤可得到作为保留物的在水中的重组蛋白浆液以及包含杂质的渗透物。合适的超滤条件(例如,膜、温度、体积置换)可使用本领域已知的方法来确定,旨在使渗透物密度最大化。在一些实施方案中,超滤
提供了密度在1g/ml和30g/ml之间的保留物。在一些实施方案中,超滤包括浓缩步骤(其产生浓缩保留物),接着为透析过滤步骤(其除去杂质并产生在水中的悬浮蛋白浆液)。在一些此类实施方案中,浓缩保留物具有体积相对于起始体积减小介于2倍和12倍之间的浓缩因子。在一些实施方案中,透析过滤提供介于3倍和10倍之间的恒定体积置换。
[0180]
根据实施方案和待除去的杂质类型,除去杂质的方法可能不同。从分离的重组蛋白中除去脂质杂质可通过本领域已知的方法来完成。此类方法的非限制性实例包括对炭或其他特异性地结合脂质的吸收介质的吸收。从分离的重组蛋白中除去多糖杂质可通过本领域已知的方法来完成。此类方法的非限制性实例包括用水解多糖的酶处理,接着除去通过超滤产生的小糖类。此类酶的非限制性实例包括葡聚糖酶、溶细胞酶、甘露糖酶和甲壳酶。
[0181]
在步骤a08中,分离被增溶的重组蛋白质。对重组蛋白质增溶。被增溶的重组蛋白可用多种不同的方法来分离,所述方法包括使用提取缓冲液、尺寸排阻谱法、凝胶过滤、超声蛋白提取和离子交换谱法。在其中在可选步骤a02中未除去生物质的一些实施方案中,重组蛋白可与重组宿主细胞一起分离。
[0182]
在一些实施方案中,重组蛋白是作为单个分离步骤或作为单个分离步骤外加其他分离步骤来沉淀。沉淀被增溶的重组蛋白可通过向发酵物中添加沉淀剂来完成。此类沉淀剂的非限制性实例包括硫酸根离子(例如,硫酸铵、硫酸钠、硫酸)或枸橼酸根离子(例如,枸橼酸钠)。在一些实施方案中,沉淀剂为酸。在一些实施方案中,沉淀剂为盐。在一个实施方案中,沉淀剂为h2so4。
[0183]
可使用任何适当的酸来调节或改变包含被增溶的重组蛋白的溶液的ph值。适宜的酸包括矿物酸,诸如盐酸(hcl)、硫酸(h2so4)、硝酸(hno3)、硼酸(h3bo3)、磷酸(h3po4)、(hf)、氢溴酸(hbr)、高氯酸(hclo4)、氢碘酸(hi);有机酸,诸如柠檬酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸(valeric acid)、己酸(caprioc acid)、草酸、乳酸、苹果酸、苯甲酸、碳酸、尿酸、牛磺酸、对甲苯磺酸、三氟甲磺酸、氨甲基膦酸和2,2,2,-三(tca);或其任何组合或本领域已知的其他适宜的酸。还可以使用上面所公开的酸中任一种酸的酸盐。
[0184]
在一些实施方案中,重组蛋白是在ph 4-10的条件下沉淀的。在一些实施方案中,沉淀在ph 4、5、6、7、8、9或10下进行。在一些实施方案中,沉淀在至少ph 4、至少ph 4.5、至少ph 5、至少ph5.5、至少ph 6、至少ph 6.5、至少ph 7、至少ph 7.5、至少ph 8、至少ph 8.5、至少ph 9、至少ph 9.5、至少ph 10下进行。在一个实施方案中,沉淀在ph 7下进行。在一些实施方案中,沉淀在ph 4-5、ph 5-6、ph 6-7、ph 7-8、ph 8-9或ph 9-10下进行。
[0185]
沉淀可根据需要重复一次、两次或许多次。在一些实施方案中,执行超过一个沉淀步骤,并且每次沉淀的ph值相同。在其他实施方案中,执行超过一个沉淀步骤,并且每次沉淀的ph值不同。例如,第一次沉淀可在ph 4下执行,然后第二次沉淀可在ph 7下执行。
[0186]
如本文所公开,分离沉淀的重组蛋白可基于尺寸、重量、密度或其组合来完成。在一些实施方案中,此类分离提供了作为保留物的悬浮的重组蛋白浆液和包含废弃物的渗透物。用于沉淀重组蛋白(例如,添加二价阴离子前的稀释、二价阴离子的类型和量、孵育温度、孵育时间)和分离沉淀的重组蛋白的合适条件可使用本领域已知的方法来确定,旨在将悬浮的重组蛋白浆液中重组蛋白的收率最大化。在一些实施方案中,悬浮的丝蛋白浆液中沉淀的重组蛋白的收率在20%和99%之间。在一些实施方案中,悬浮的丝蛋白浆液具有介于30%和65%之间的湿填充固体含量。在一些实施方案中,悬浮的丝蛋白浆液包含丝蛋白,
其浓度介于10g/l和50g/l之间。在一些实施方案中,沉淀丝蛋白和分离沉淀丝蛋白的步骤至少重复一次(使用相同或不同的工艺条件)以进一步洗去水溶性杂质。
[0187]
在可选步骤a10中,浓缩分离的重组蛋白。浓缩分离的重组蛋白可通过在高温和/或减压(例如,部分真空)下蒸发来完成。用于浓缩分离的重组蛋白的合适条件(例如,温度、压力、持续时间)可使用本领域已知的方法来确定,旨在获取具有增加的干固体含量的分离的重组蛋白。在一些实施方案中,浓缩提供了原始体积的介于20%和70%之间的体积减小。在一些实施方案中,浓缩提供了包含介于3%和20%之间的干固体的浓缩的分离重组蛋白。
[0188]
在可选步骤a12中,干燥分离的重组蛋白。干燥悬浮的丝蛋白浆液以获得丝蛋白粉末可通过喷雾干燥、滚筒干燥器、冻干或流化床干燥来完成。在一些实施方案中,该粉末具有小于10%、小于9%、小于8%、小于6%、小于5%、小于4%、小于3%、小于2%或小于1%的水分含量。
[0189]
图2描绘了根据本发明的一个实施方案的分离重组蛋白的工艺流程。本领域的技术人员将理解,图2所示的一些步骤可以按照交替顺序和/或重复进行。本领域的技术人员将认识到,所公开的实施方案并不打算限制本文所提供方法的范围,并且所述方法可以基于所使用的重组宿主细胞、期望累积收率、累积滴度和/或累积生产率或其他因素而变化。
[0190]
在步骤b05中,裂解和/或以其他方式破坏重组宿主细胞,以使得重组宿主细胞的内容物释放到发酵物中。根据实施方案,重组宿主细胞可使用各种不同的方法进行破坏。裂解和/或破坏宿主细胞的合适方法包括:使用热量诸如高温短时(htst)方法、高剪切细胞破坏、物理匀质化和化学匀质化等。
[0191]
在可选步骤b04中,如上面针对步骤a04所描述的那样对重组蛋白进行增溶。步骤b04可在步骤b05之前或之后执行。在一些实施方案中,步骤b04可以在步骤b05之前和之后执行。
[0192]
在可选步骤b02中,如上面针对步骤a02所描述的那样除去生物质。此外,在对重组蛋白进行增溶的情况下,从裂解和/或被破坏的细胞中除去生物质的其他方法可包括离心和过滤。
[0193]
在可选步骤b06中,如上面针对步骤a06所描述的那样除去杂质。步骤b02和b06可在其他步骤之前或之后执行,并且可重复执行。在一些实施方案中,步骤b06可以在步骤b08之前和之后执行。
[0194]
在步骤b08中,分离重组蛋白。上文针对步骤a08描述了用于分离重组蛋白的合适方法。此外,用于分离重组蛋白的方法还可以包括在过滤和/或脱胶中使用额外的膜以除去磷脂。
[0195]
在可选步骤b10中,如上面针对步骤a10所描述的那样浓缩重组蛋白。在可选步骤b12中,如上面针对步骤b10所描述的那样干燥重组蛋白。
[0196]
图3描绘了根据本发明的一个实施方案的重组蛋白纯化的工艺流程。本领域的技术人员将理解,图3所示的一些步骤可以按照交替顺序和/或重复进行。本领域的技术人员将认识到,所公开的实施方案并不打算限制本文所提供方法的范围,并且所述方法可基于各种因素而改变。
[0197]
在步骤c02中,通过利用强离液剂使重组蛋白变性来制备水性两相溶液。合适的离液剂包括但不限于:硫氰酸胍(gd-scn)、盐酸胍(gd-hcl)、碘化胍、尿素、高氯酸锂、醋酸锂、
氯化镁、十二烷基硫酸钠(sds)、碘化钾(ki)或其任何组合。根据实施方案,可加热离液剂和蛋白质以促进蛋白质变性。
[0198]
在一些实施方案中,向所述溶液中加入结构构造剂(kosmotrope)(本文中也称为“沉淀剂”)以促进相分离。合适的结构构造剂包括上面提及的沉淀剂。在其他实施方案中,使用高起始浓度的离液剂使重组蛋白变性,然后缓慢地稀释离液剂的浓度以便获得相分离。
[0199]
在步骤c04中,获得相分离的粘性层。根据相分离的类型,可使用各种方法获得粘性层,诸如倾析/提取非粘性层或使用hamilton针头或移液器提取粘性层。其他方法将为本领域的技术人员已知。
[0200]
作为步骤c06,进一步处理相分离的粘性层以除去杂质。合适的透析剂包括双蒸h2o或低浓度的gd-scn。根据实施方案,可执行各种透析方法,包括卡式透析(cassette dialysis)或本领域已知的其他合适方法。在一些实施方案中,使用正切向流动过滤(tff)透析粘性层。
[0201]
在一些实施方案中,分离的重组蛛丝蛋白为至少60%、至少为65%、至少为70%、至少为75%、至少为80%、至少为85%、至少为90%、至少为95%或至少为99%的全长重组蛛丝蛋白。
[0202]
在一些实施方案中,分离的重组蛛丝蛋白的纯度为5-10%、10-15%、15-20%、20-25%、25-30%、30-35%、35-40%、45-50%、50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%、75-80%、80-85%、85-90%、90-95%或95-100%。在一些实施方案中,分离的重组蛛丝蛋白的纯度为至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少100%。
[0203]
在一些实施方案中,测量或定量了全长重组蛛丝蛋白。可使用任何适宜的方法测量或定量全长重组蛋白的量,所述方法包括但不限于尺寸排阻谱法(sec)、sds-page、免疫印迹(蛋白质印迹)、高效液相谱法(hplc)、液相谱-质谱法(lc-ms),或快速蛋白液相谱法(fplc),或本领域已知的任何其他适宜的方法,或其任何组合。在一个实施方案中,使用蛋白质印迹法测定了全长重组蛛丝蛋白的量。在另一个实施方案中,使用尺寸排阻谱法(sec)测量了全长重组蛛丝蛋白的量。
[0204]
实施例
[0205]
下文是用于执行本发明的具体实施方案的实施例。这些实施例的提供仅为了进行示意性的说明,不旨在以任何方式限制本发明的范围。对于所使用的数字(例如,量、温度等),已尽力确保精确度,但是当然应该允许一些实验误差和偏差。
[0206]
除非另外指明,否则本发明的实践将利用本领域的技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组dna技术和药理学的常规方法。此类技术在文献中有全面的解释。参见,例如,t.e.creighton,proteins:structures and molecular properties(w.h.freeman and company,1993);a.l.lehninger,biochemistry(worth publishers,inc.,现行版);sambrook等人,molecular cloning:a laboratory manual(第2版,1989);methods in enzymology(s.colowick和n.kaplan,编者,academic press,inc.);remington's pharmaceutical sciences,第18版(easton,pennsylvania:mack publishing company,1990);carey和sundberg advanced organic chemistry第3版(plenum press)a卷和b卷
(1992)。
[0207]
实施例1:使用单步碱性条件进行18b纯化
[0208]
使用高ph值溶液增溶重组蛋白而不破坏分泌重组蛋白的宿主细胞。测试ph值缓冲液浓度和孵育时间,以确定巴斯德毕氏酵母(p.pastoris)中表达的带有c-末端3x flag标签(seq id no:40)的横纹金蛛(argiope bruennichi)masp2嵌段(“18b”,seq id no:38)的重组蛛丝蛋白的溶解度。flag标签是用甘氨酸残基(g)接头连接在18b肽序列的c末端。
[0209]
具体而言,给细胞培养物发酵肉汤接种表达18b重组蛋白的巴斯德毕氏酵母(pichia pastoris),并孵育以允许表达18b蛋白。离心培养物以收获细胞,并将细胞团块以1:1(等量的细胞团块和水)或1:3(一份细胞团块和两份水)的比例重悬于蒸馏水中。用2-10m naoh将细胞团块悬浮液的ph值调节至最终ph值11.8-11.9。将细胞团块悬浮液在室温下在搅拌下孵育15-30分钟。孵育期间用naoh调节ph值以维持ph值为11.8-11.9。离心细胞团块悬浮液,并收集含有重组蛋白的上清液。将上清液冻干以浓缩18b蛋白,并如下所述的那样通过尺寸排阻谱法(sec)评估回收的18b蛋白量(图4a和4b)。
[0210]
使用尺寸排阻谱法(sec)分析高分子量杂质、低分子量杂质和中等分子量杂质、单体18b和聚集体18b的相对含量。将18b粉末溶解于5m硫氰酸胍(gdscn)中,并进样至yarra sec-3000sec-hplc谱柱上以根据分子量分离成分。将折光率用作检测模式。对18b聚集体、18b单体、低分子量(1-8kda)杂质、中等分子量杂质(8-50kda)和高分子量杂质(110-150kda)进行了定量。相关组成是以质量%和面积%报告的。使用bsa作为一般蛋白标准品,假设所有蛋白质中》90%的蛋白质显示出dn/dc值(折光率的响应因子)在彼此的约7%范围内。使用聚(环氧乙烷)作为保留时间标准品,并使用bsa校准品作为检查标准品,以确保该方法具有一致的表现。作为对照品,还评估了使用尿素増溶18b蛋白所纯化的样品。
[0211]
在ph 11.9下从巴斯德毕氏酵母细胞团块中进行18b的碱性提取,得到针对使用5m gdscn分离的18b蛋白量归一化的70-75%的全长18b蛋白提取收率。使用提取的18b蛋白的sec面积%计算样品的纯度。碱性提取物中18b单体的纯度为约35%单体面积、35%中等分子量杂质面积和28%低分子量杂质面积%(图4a和4b)。相比之下,用10m尿素増溶18b蛋白导致18b蛋白的收率较低,约为26%单体面积、27%中等分子量杂质面积和45%低分子量杂质面积。这些数据表明,碱性增溶和提取方法导致18b收率较大以及分离的18b蛋白的纯度较高。
[0212]
实施例2:分离的丝多肽的进一步纯化
[0213]
为进一步纯化18b蜘蛛蛋白,使用750k mw过滤器和8个透析体积(diavolume)的水,对从以上碱性提取中分离出的18b样品进行超滤和正切向流动过滤。如前所述的那样,通过sec评估包含未经过滤的蛋白、经超滤的蛋白以及在1、3、6和8个透析体积的水后的蛋白的样品。每种样品中18b单体、中等分子量杂质、低分子量杂质和高分子量杂质的sec%面积在图5中示出。最左侧的棒上示出了未经过滤的蛋白样品(“未经调节的进料”),左侧第二个棒上示出了经超滤的蛋白样品(“未经调节的ufr”),1、3、6或8个透析体积的样品分别在中左、中右、从右侧数第二个和最右侧棒中示出(图5)。洗涤的透析体积增加导致18b单体的%面积增加以及低分子量杂质的%面积减少。
[0214]
实施例3:使用两步碱性提取进行18b纯化
[0215]
为了增加细胞中18b蛋白质的回收率,还执行了两步提取工艺。用2m naoh作为第
一个碱性提取步骤,将表达18b的巴斯德毕氏酵母细胞的全细胞肉汤的ph值调节至ph 11.8并孵育30-60分钟。将表达18b的巴斯德毕氏酵母细胞的全细胞肉汤的对照样品与5mgdscn一起孵育约15分钟,以增溶和提取18b蛋白。使细胞形成团块并收集上清液。作为第二个提取步骤,通过以1:1、1:2或1:3的团块:水比例添加ph 11.8的水来对来自第一个碱性提取步骤的剩余团块进行再提取。收集含有重组18b蛋白的第一次和第二次碱性提取的上清液。冻干上清液以浓缩18b蛋白,并按照先前实施例1中所述的那样通过sec评估样品。示出了每个提取条件和gdscn对照的两次单独实验运行(图6a)。增加碱性水的量(1:2和1:3的比例)增加了回收的18b蛋白的量。然而,双重提取18b单体蛋白的纯度在单次提取时最高。随着第二次提取中使用的碱性水相对于团块的增加,18b单体的纯度也增加(图6b)。
[0216]
然后,如前所述的那样使用750k mw过滤器和最高8个透析过滤体积的水,通过超滤和正切向流动过滤纯化来自提取的样品。通过sec评估由此获得的丝多肽组合物的纯度(图7a和7b)。图7a示出了18b单体、中等分子量杂质和低分子量杂质的%面积。正切向流动过滤期间透析体积增加导致18b单体峰面积增加。图7b示出了每种样品、起始物料(“sm”)、经超滤的保留物(“uf r”)和正切向流动过滤透析体积样品1、2、3、4、6和8(df 1、2、3、4、6、8)的sec峰。
[0217]
实施例4:通过改变ph值从碱性提取物中进一步分离出丝多肽
[0218]
通过调节提取物的ph值,使来自碱性提取物的18b重组蛋白从碱性提取物中沉淀出来。在此实验中,从全细胞培养肉汤进行的碱性提取首先通过加入naoh调节全细胞培养肉汤的ph值至最终ph11.8-11.9,从而产生碱性细胞悬液来执行。将细胞悬液在室温下在搅拌下孵育15-30分钟。孵育后,离心细胞悬液,收集含有被增溶的18b蛋白的碱性上清液以产生18b碱性提取物。
[0219]
然后,用不同ph条件处理18b碱性提取物样品以使18b蛋白沉淀。向碱性提取物样品中加入h2so4至最终ph值为4、5、6、7、8、9或10。然后,从碱性提取物中分离出含有18b重组蛋白的沉淀。如前所述的那样通过sec评估沉淀样品。图8示出了每种ph值条件下高分子量(hmw)峰、18b单体和聚集体峰、中等分子量(imw)峰和低分子量(lmw)峰的sec%面积纯度。图9示出了在测试的每种沉淀剂ph值下18b蛋白的收率%。在所有条件中,在初始碱性提取18b蛋白后,发现单阶段沉淀法的沉淀步骤ph值为7最有效,其中约70%的%面积表明纯度约为70%。图10示出了在ph 6下18b沉淀物的sec图谱。
[0220]
除透析离心外,还执行了tff(正切向流动过滤)以分离出碱性提取物。然而,透析离心在去除杂质方面比tff更有效,并且一般达到60-70%的蛋白回收率和》70%的18b蛋白纯度。
[0221]
将在ph 6下获得的18b蛋白沉淀冻干,湿纺成纤维,并对其进行韧性测量。将冻干的18b蛋白溶解于甲酸中至最终蛋白量为36wt%。将溶解的蛋白以40μl/min挤出至100%乙醇凝结浴中以产生纤维。通过该方法生产的18b纤维具有19.4cn/tex的韧性。
[0222]
实施例5:使用碱性条件进行的p0回收与使用盐沉淀进行的p0回收的对比
[0223]
测试ph值缓冲液浓度和孵育时间,以确定它们在大肠埃希菌细胞裂解液中增溶p0(seq id no:39)重组丝蛋白用于从细胞培养物中提取方面的用途。
[0224]
给细胞培养发酵肉汤接种表达具有c末端6x-his标签的p0重组蛋白的大肠埃希菌,并孵育以允许表达p0蛋白。将培养物以15,000rcf离心以使细胞形式团块。除去上清液,
以1:4(细胞团块:缓冲液)或1:9(细胞团块:缓冲液)的比例将细胞团块重悬于h2o中,并孵育15-60分钟。用naoh将重悬细胞团块的ph值调节至最终ph 9、10、10.5或11。作为对照,也将重悬的细胞团块样品与5m硫氰酸胍(gdscn)一起孵育并超声处理1.5分钟。涡旋样品,并使用rotisserie混合器匀质化。通过以15,000rcf离心5分钟来净化裂解物,并保留经净化的含有p0蛋白的上清液。使用0.25μm过滤上清液,并通过bca、elisa和免疫印迹进行分析。
[0225]
将样品针对1mg/ml蛋白浓度作归一化,并使用抗his抗体通过免疫印迹法评估每种样品中被增溶的p0量(图11)。泳道h1是在5mgdscn中通过超声裂解的对照样品。泳道b1-b4是以1:4细胞团块:缓冲液(ph 9、ph 10、ph 10.5和ph 11)的比例混合的样品,泳道b7-b10是以1:9细胞团块:缓冲液(ph 9、ph 10、ph 10.5和ph 11)的比例混合的样品。泳道c2-c4是与gdscn一起孵育15、30或60分钟的样品。
[0226]
在示例性方法中,给细胞培养物发酵肉汤接种表达p0重组蛋白的大肠埃希菌,并孵育以使p0蛋白表达。将培养物以15,000rcf离心以使细胞形式团块。将细胞团块以1:1或1:3的细胞团块:液体比重悬于h2o中,并将细胞悬液在10,000至40,000psi下匀质化,以裂解大肠埃希菌细胞。通过离心净化裂解液,并保留含有不溶性p0的细胞团块。将细胞团块重悬于h2o中,并用2-10m naoh调节细胞团块悬浮液的ph值至最终ph 11.5。将细胞团块悬浮液在室温下在搅拌下孵育15-60分钟。用naoh调节ph值,以使孵育期间的ph值保持在11.5。孵育后,离心细胞悬液,收集含有重组p0蛋白的上清液。
[0227]
作为额外的方法,还可以使用含10m尿素的碱性缓冲液从细胞团块中提取不溶性p0。在用h2o重悬细胞团块后,用2-10m naoh调节细胞团块悬浮液的ph值至最终ph值为11.5,并添加尿素至尿素的最终浓度为10m。将细胞团块悬浮液在室温下在搅拌下孵育15-60分钟。
[0228]
在所有方法中,分离的重组p0蛋白可通过额外的净化步骤诸如过滤、离心、沉淀或层析来进一步纯化。
[0229]
等效方案
[0230]
虽然已经参考优选的实施方案和各种替代实施方案对本发明进行特别展示和描述,但相关领域的技术人员应理解,在不脱离本发明的精神和范围的情况下可对其做出形式和细节上的改变。
[0231]
本说明书的正文中引用的所有参考文献、已授权的专利和专利申请,都通过引用以其整体并入本文用于所有目的。
[0232]
非正式序列表
[0233]
[0234]

技术特征:


1.一种从宿主细胞培养物中分离出重组蛛丝蛋白的方法,其包括:a.获得细胞培养物,其中所述细胞培养物包含宿主细胞和生长培养基,其中所述宿主细胞表达重组蛛丝蛋白;b.收集所述细胞培养物的包含所述重组蛛丝蛋白的部分;c.在碱性条件下在水溶液中孵育所述细胞培养物的所述部分,从而在所述水溶液中增溶所述重组蛛丝蛋白;以及d.从所述水溶液中分离出所述重组蛛丝蛋白,从而产生分离的重组蛛丝蛋白样品。2.如权利要求1所述的方法,其中所述碱性条件包括从9至14的碱性ph值。3.如权利要求2所述的方法,其中所述碱性ph值是从11至12。4.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述分离的重组蛛丝蛋白是全长重组蛛丝蛋白。5.如权利要求4所述的方法,其中所述分离的重组蛛丝蛋白样品包含相对于总的分离的重组蛛丝蛋白的至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的全长重组蛛丝蛋白。6.如权利要求5所述的方法,其中全长重组蛛丝蛋白的百分比是使用蛋白质印迹法测量的。7.如权利要求5所述的方法,其中全长重组蛛丝蛋白的百分比是用尺寸排阻谱法测量的。8.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述分离的重组蛛丝蛋白的纯度为5-10%、10-15%、15-20%、20-25%、25-30%、30-35%、35-40%、45-50%、50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%、75-80%、80-85%、85-90%、90-95%或95-100%。9.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述分离的重组蛛丝蛋白的收率相对于通过尿素或硫氰酸胍法分离的重组蛛丝为至少50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%、75-80%、80-85%、85-90%、09-95%或95-100%。10.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中分离所述重组蛛丝蛋白包括通过改变所述水溶液的所述碱性条件来沉淀所述重组蛛丝蛋白。11.如权利要求10所述的方法,其中改变所述碱性条件包括将所述细胞培养物的所述部分的所述碱性ph值调节至从4至10的降低的ph值。12.如权利要求11所述的方法,其中所述降低的ph值为4、5、6、7、8、9或10的ph值。13.如权利要求11所述的方法,其中所述降低的ph值是从6至7的ph值。14.如权利要求10-13中任一项所述的方法,其中调节所述碱性ph值包括添加酸到所述水溶液中。15.如权利要求14所述的方法,其中所述酸为h2so4。16.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述细胞培养物的所述部分包含上清液、全细胞肉汤或细胞团块。17.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中收集所述细胞培养物的所述部分包括从所述生长培养基中移出所述宿主细胞,并在所述水溶液中重构所述宿主细胞。18.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中收集所述细胞培养物的所述部分包括
裂解所述宿主细胞。19.如权利要求18所述的方法,其中裂解包括热处理、剪切破坏、物理匀质化、超声或化学匀质化。20.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述细胞培养物的所述部分包含来自所述细胞培养物的所述宿主细胞和所述生长培养基。21.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述水溶液包含稀释的生长培养基。22.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中在碱性条件下孵育所述细胞培养物的所述部分被执行10至120分钟。23.如权利要求22所述的方法,其中在碱性条件下孵育所述细胞培养物的所述部分被执行至少10分钟、至少15分钟、至少30分钟、至少45分钟、至少60分钟、至少75分钟、至少90分钟、至少105分钟或至少120分钟。24.如权利要求22所述的方法,其中在碱性条件下孵育所述细胞培养物的所述部分被执行15至30分钟。25.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中在碱性条件下孵育所述细胞培养物的所述部分进一步包括搅拌所述细胞培养物的所述部分。26.如前述权利要求中任一项所述的方法,其进一步包括在碱性条件下从所述水溶液中除去未被增溶的生物质。27.如权利要求26所述的方法,其中除去所述未被增溶的生物质包括过滤、离心、重力沉降、吸附、透析或相分离。28.如权利要求27所述的方法,其中所述过滤是超滤、微量过滤或透析过滤。29.如权利要求26-28中任一项所述的方法,其中除去所述未被增溶的生物质被重复至少一次。30.如前述权利要求中任一项所述的方法,其进一步包括在分离所述重组蛛丝蛋白之前或者在分离所述重组蛛丝蛋白之后除去杂质。31.如权利要求30所述的方法,其中除去杂质包括过滤、离心、重力沉降、吸附、透析或相分离。32.如权利要求31所述的方法,其中所述过滤是超滤、微量过滤或透析过滤。33.如权利要求31所述的方法,其中所述离心是超速离心或透析离心。34.如权利要求31所述的方法,其中所述吸附是炭吸附。35.如权利要求31-34中任一项所述的方法,其中去除杂质被重复至少一次。36.如前述权利要求中任一项所述的方法,其进一步包括浓缩所述分离的重组蛛丝蛋白以产生浓缩的蛛丝蛋白。37.如权利要求36所述的方法,其中浓缩包括沉淀、过滤、超滤、离心、透析、蒸发或冻干。38.如前述权利要求中任一项所述的方法,其进一步包括干燥所述分离的重组蛛丝蛋白。39.如前述权利要求中任一项所述的方法,其进一步包括由所述分离的重组蛛丝产生丝纤维。40.如权利要求39所述的方法,其中所述丝纤维包括至少19cn/tex的韧性。
41.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述重组蛛丝蛋白为18b或p0。42.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述细胞培养物包含真菌细胞、细菌细胞或酵母细胞。43.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述酵母细胞为巴斯德毕氏酵母细胞。44.一种分离重组蛛丝蛋白的方法,所述方法包括a.获得细胞培养物,其中所述细胞培养物包含宿主细胞和生长培养基,其中所述宿主细胞表达重组蛛丝蛋白;b.收集所述细胞培养物的包含所述重组蛛丝蛋白的部分;c.在碱性条件下在水溶液中孵育所述细胞培养物的所述部分,从而在所述水溶液中增溶所述重组蛛丝蛋白;d.调节所述水溶液至非碱性ph值,从而沉淀所述被增溶的重组蛛丝蛋白;以及e.从细胞培养物的所述部分中分离出所述重组蛛丝蛋白,从而产生分离的重组蛛丝蛋白。45.一种组合物,其包含通过前述权利要求中任一项所述的方法产生的重组蛛丝蛋白。46.如权利要求45所述的组合物,其中所述重组蛛丝包含至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%的全长重组蛛丝。47.一种丝纤维,其包含通过权利要求1-44中任一项所述的方法产生的重组蛛丝蛋白。48.如权利要求47所述的丝纤维,其中所述丝纤维包括至少19cn/tex的韧性。49.一种组合物,其包含在碱性缓冲液中的细胞培养物,所述细胞培养物包含生长培养基和宿主细胞,所述宿主细胞包含重组蛛丝蛋白。50.如权利要求45-49中任一项所述的组合物,其中所述碱性缓冲液具有从9至14的ph值。51.如权利要求50所述的组合物,其中所述ph值是从11至12。52.如权利要求49-51中任一项所述的组合物,其中所述蛛丝蛋白为18b或p0。53.如权利要求49-52中任一项所述的组合物,其中所述细胞培养物包含真菌细胞、细菌细胞或酵母细胞。54.如权利要求53所述的组合物,其中所述细菌细胞是大肠埃希菌细胞。55.如权利要求53所述的组合物,其中所述酵母细胞是巴斯德毕氏酵母细胞。

技术总结


本公开涉及生产和纯化合成嵌段共聚物蛋白的方法、用于分泌所述合成嵌段共聚物蛋白的表达构建体、用于生产所述合成嵌段共聚物蛋白的重组微生物以及包含这些蛋白的合成纤维,所述合成纤维再现了天然丝的许多特性。述合成纤维再现了天然丝的许多特性。述合成纤维再现了天然丝的许多特性。


技术研发人员:

梅嘉恒 R

受保护的技术使用者:

保尔特纺织品公司

技术研发日:

2019.11.26

技术公布日:

2022/4/26

本文发布于:2022-11-24 15:21:14,感谢您对本站的认可!

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