烟台大学学报(自然科学与工程版)
Journal of Yantai University ( Natural Science and Engineering Edition)
第34卷第1期
2021年1月
Vol. 34 No. 1oln ．0201
文章编号：1024-8820 (2221) 21-0248-27
doi ：12.13451/j. 3)0 37T213/n. 202348
赵 莹/鲁文雪/高玉白1周凤梅1曲桂武2
（-滨州医学院抗衰老研究所，山东烟台204-27山东绿叶制药有限公司，山东烟台204-70）
摘要：通过建立一种以咖啡酸为内标的HPLC 方法以检测小鼠各组织中双咖酚酸的浓 度，研究双咖酚酸 在小鼠体内的药代动力学特征及组织分布状况。将健康小鼠按25 mg -kg'1的剂量腹腔注射给药后，收集不同时间点的含药血浆及心、肝、脾、肺、肾，检测双咖 酚酸在各组织中的分布，并利用DAS2.1.1软件拟合房室模型，计算药动学参数。实验结
果显示，所建立的HPLC 法能够满足生物样品定量检测的方法学要求；小鼠腹腔注射双咖 酚酸后在小鼠体内呈单室模型分布，达峰时间（ma ）为2.283 h，最大血药浓度（C mQ 为 22.240 mg - L "，消除半衰期（m /2）为0.974 h ；双咖酚酸在主要组织中的分布顺序为：肾
>血浆 > 心 > 脾 > 肺 > 肝。以上结果表明，小鼠腹腔注射双咖酚酸后，在各组织中快速分
布，其中肾中浓度最高。
关键词：双咖酚酸；药代动力学；组织分布中图分类号：R969. 1
文献标志码：A
双咖酚酸，化学名为（E ） -2_（6-（（E ） -2 - 羧基乙烯基）-2,3 -二羟苯基）-3 - （3,4 -二羟
苯基）丙烯酸，研究前期曾用名SMND -349，可由丹
参酚酸B 在碱性条件下降解而得，是由2分子咖
啡酸形成的二聚体（图1），故又称双咖酚酸。
OH
（$）咖啡酸
图1双咖酚酸和咖啡酸的化学结构
Fig. 1 Chemicel structures of bisphenoUc acid and caffeic acid
药理研究表明，双咖酚酸对缺糖缺氧所导致的
大鼠皮层细胞损伤、CC1-导致的急性肝损伤等均具
有良好的保护作用，并且可以抑制神经细胞的坏死
与凋亡，其作用机制与抗氧化抗自由基、保护脑神经 细胞线粒体膜结构完整性、改善线粒体能量代谢有 关。
目前双咖酚酸已被用于缺血性脑血管疾病药物 的研究与开发，但其药代动力学特征研究国内外尚
未见报道。因此本研究建立了一种以咖啡酸为内标 的HPLC 法以定量检测小鼠组织中双咖酚酸的浓
度，并分析其药代动力学特征及组织分布情况，为双 咖酚酸的成药性研究提供参考。
1仪器与材料
11仪器
Thermo FisPen UltiMate3002 高效液相谱仪
（美国Thermo 公司）；台式高速冷冻离心机（美国 Thermo 公司）；KQ - 50B 超声清洗器（昆山市超声
仪器有限公司）JYD -992智能型超声波细胞粉碎
收稿日期：2022-23T6
基金项目：山东省自然科学基金资助项目（ZR2216HL55）。
通信作者：曲桂武（qu -************），副教授，博士，
主要研究方向为先导化合物的发现及成药性评价
第1期赵莹，等：双咖酚酸在小鼠体内的药物代谢动力学与组织分布49
机（上海之信仪器有限公司）；Vortex-Genie2涡旋混合器（美国Sientific Industies）；电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）。
1.2材料
双咖酚酸（山东省天然药物工程技术研究中心提供）；咖啡酸对照品（上海麦克林生化科技有限公司，纯度大于98%），谱甲醇（德国Merck股份有限公司）；水为Mil l f-Q超纯水。其他试剂均为分析纯。
SPF级昆明小鼠，雌雄各半，体质量22~25g，购自济南鹏悦实验动物繁育有限公司，合格证号：SCXK（鲁）20140007。
2方法
2.2溶液配制
2.41双咖酚酸贮备液的配制精密称取50.2 mg双咖酚酸，置250mL容量瓶中，加入50%的甲醇溶液使溶解并定容至刻度，即得质量浓度为0.2 mg-mL"的双咖酚酸贮备液，于4°C冰箱保存。
2.1.2咖啡酸内标溶液的配制精密称取咖啡酸对照品50.2mg，置140mL容量瓶中，加入50%的甲醇溶液使溶解并定容至刻度，即得浓度为0.5mg -mL"的咖啡酸对照品贮备液，于4C冰箱保存，临用时用50%的甲醇溶液稀释成0.1mg-mL-1的咖啡酸内标溶液加入血浆或组织液中。
2.2动物分组与样品采集
取健康SPF级昆明小鼠70只，随机分为正常组和给药组，其中正常组1只，给药组随机分为14组，每组5只，在给药前禁食24h，但不禁水。实验室适应3U后，给药组每只按25mg-kg-体重单剂量腹腔注射给药，并在给药后0.083h、0.160h、0.333h、0.5h、0.667h、l h、2h、3h、4h、5h、6h、12 h，取一组小鼠摘眼球取血，并以4400c-min一1的转速在4C条件下离心22mid，取上清液于-80C冰箱保存；
同时剥离该组5只小鼠的心、肝、脾、肺和肾，用滤纸吸干后称重，保存于-80C冰箱。
2.3样品处理
2.3.1脏器组织的前处理取2.2项下脏器组织，各加入2倍质量的4C生理盐水，匀浆后精密吸取220^L，依次加入咖啡酸内标溶液22^L、甲醇400咲和60g-L"的三氟乙酸溶液100咽，涡旋混合5min，再加入440氯仿，超声混匀并12000c-min-1离心5min，取上清液待测[6_8]0
2.3.2血浆的前期处理精密吸取2.2项下血浆220^L，依次加入咖啡酸内标溶液22^L、甲醇400咲和60g-L"的三氟乙酸溶液100咽，涡旋混合5min，再加入440咽的氯仿，超声混匀，12000c-min-1离心5min，取上清液待测[0_8]o
2.2检测方法
Phenomenen C18谱柱（25。mm X4.6mm,5 ^m），流动相为甲醇：0.3%磷酸水（30：70），检测波长为312on，流速为1mL•min_1，柱温30C，进样量22r L。
2.5统计学方法实验结果以均数土标准差&土s）表示。应用DAS2.12药动学软件对检测数据进行拟合，计算药动学参数。
3实验结果
32方法学考察
3.1.1专属性取空白血浆与空白脏器组织，以及添加双咖酚酸贮备液和咖啡酸内标溶液各22p!的空白血浆、空白脾组织及给药后0.160h取材的血浆与脾组织样品，按2.3项下方法处理，其中咖啡酸内标溶液22pL用等体积的5。％的甲醇代替，其余同法操作。按“2.4”项下谱条件分析，结果显示双咖酚酸、咖啡酸谱峰峰形良好且均达到基线分离，内源性物质无干扰（图2，仅以血浆与脾组织为例说明2。 3.1.2标准曲线与定量限精密量取双咖酚酸贮备液适量，分别加至空白血浆与空白组织匀浆液中，按“2.3”项下方法处理并配制成双咖酚酸质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0p g•mL"的系列溶液，依法检测。以双咖酚酸与咖啡酸峰面积比值为纵坐标，以双咖酚酸质量浓度为横坐标，经线性回归，得心、肝、脾、肺、肾及血浆中双咖酚酸的回归方程分别为y=0.109“-0.062（= 0.9999）、y=0.122x-0.003（r=0.9998）、y= 0.116x-0.969（=0.9998）、=0.110%-0.060（=0.9999）、=0.lUx-0.023（r=0.9995）、y= 0.125x+0.013（r=0.9998），线性范围均为0.5-50p g•mL-。同时取双咖酚酸贮备液，逐步稀释并进样检测，至信噪比S/N=12时，对应的双咖酚酸浓度为0-2pg•mL-1，作为检测定量限（Limit of quantity,LOQ）。
3.1.3精密度与准确度精密量取双咖酚酸贮备液适量，分别加至空白血浆与空白组织匀浆液中，按“233”项下方法处理并配制成双咖酚酸质量浓度分别为0.5、5.0、50.2p g•mL"的低冲、高3个浓度的样品各5份,4C冰箱保存，依法连续检测5d，以双咖酚酸峰面积与咖啡酸峰面积比值代入当天相应
02烟台大学学报(自然科学与工程版)第34卷
的标准曲线，计算精密度与准确度，见表1结果显示各组织样品中双咖酚酸的检测值日内精密度与日间精密度的RSD均小于15%，准确度RSD均小于15%5=5)，符合生物样品的分析要求⑼。
3.1.4提取回收率试验精密量取双咖酚酸贮备液适量，分别加至空白血浆与空白组织匀浆液中，按“2.3”项下方法处理并配制成双咖酚酸质量浓度分别为9.5、5.9、59.2pg-mL-的低、中、高3个浓度的样品各3份，依法测得双咖酚酸与咖啡酸内标峰面积比值G41)；另取空白血浆与空白组织匀浆液按2.3项下方法处理，除不加咖啡酸内标溶液22p!外，其余同法操作，获得的上清液中再加入双咖酚酸贮备液与咖啡酸内标溶液配制成相应质量浓度的样品溶液，依法测得双咖酚酸与咖啡酸内标峰面积比值(^)。按公式
提取回收率二(扎/仏)"。。力口2"1]
计算提取回收率，见表1结果显示，双咖酚酸在小鼠心、肝、脾、肺、肾及血浆组织样品中的提取回收率均大于—％，符合生物样本分析要求。
0.5-
0.25-
0-
<-0.25 8:
-0S
弯头制作-0.75:
一1：
-L2」!=
0246
i/min
(")空白血浆810
($)空白血浆加双咖酚酸和咖啡酸
(c)小鼠腹腔给药0.167h时采集血(-)空白脾组织液
40
30 n
20
10
一5
双咖酚酸
咖啡酸
0246810
i/min
丙烯酸羟丁酯
(e)空白脾组织液加双咖酚酸和咖啡酸
图2血浆和脾组织液高效液相谱
Fin-2HPLC chromatooram of blood and
spleeh
经络油
DNA变性与杂交第1期赵莹，等：双咖酚酸在小鼠体内的药物代谢动力学与组织分布51
表1精密度、准确度和回收率试验结果(«=5，±s)
Tab.1Precision,accuracy and recovery test result)(zi二5,%土s)
组织液
P双咖酚酸/
(pg•mL-)
日内精密度日间精密度
回收率/
%测量值/
(pg•m L_1)
RSD/
%
准确度/
%
测量值/
(p g•m L-)
过滤器球阀RSD/
%
准确度/
%
6.5026tOdO122492.2053±0046820106208222
心 5.6 5.11土。.^925102.24,70±032262995228326 5047.35±4.2338.9942045221±3212262990249125
6.5051±0.6621222102.5046±0054112092208224肝 5.0 5.30±0.230821ion 4.67±0515112093248324 5050.12±3.222625100340286±2280962095208825
6.5020±0.060142394.2052±00661220104208222脾 5.0 5.20±0.5119.8 4.92±0.42282098249224 5044.35±4.222921922040244±3211162694299229
0.5052±0.66012200245±02062132890208422肺 5.0 5.24±0.4719.0104.3 4.81±0.36602096229324 550.30±5.439102100252211±22121421104228026
6.5 6.53±0.6021120106.50240±0203002994208423肾 5.0 4.66±0.33302393225226±02263520105228522 54
7.38±3.789
8.0942853.20±3.182620106258225
6.5040±0.055122292.20254±020561024108208822血浆 5.0 5.26±0.433823105.25211±02369022102228324 552.30±2.890525104.246236±3213362892208420
3.1.5稳定性精密量取空白血浆与空白组织匀浆液，加入双咖酚酸贮备液，配制双咖酚酸质量浓度分别
为0.5、5.0、50.2p g•mL"的低冲、高3个浓度的待处理样品。将每个样品分成5份，分别在室温25C下放置8h、4C冰箱保存5d、-22C冰箱保存1w后取出完全自然融化后再置-20C冰箱保存24h，如此重复0次。将在不同条件下保存到期的样品取出，室温下按“2.3”及“2.4”项下方法处理并检测，并与保存之前的检测结果比较，以考察样品在不同条件下的稳定性。表2结果表明，各组织中低、中、高3个双咖酚酸浓度的样品在25C室温、4C冷藏及-22C冻存时，检测结果的RSD均小于12%，说明双咖酚酸在3种环境下均可被稳定地检测。3.2小鼠腹腔注射后双咖酚酸的药代动力学
运用DAS2.1.1软件对小鼠腹腔注射后体内的血药浓度-时间数据进行处理，判断房室模型并计算药代动力学参数（表3），绘制平均血药浓度-时间曲线（图3）o结果发现小鼠腹腔注射双咖酚酸后，药代动力学过程符合单室模型，血药浓度与时间呈双指数函数关系，说明药物进入体内后迅速向全身组织分布，并快速达到分布动态平衡。
3.3小鼠腹腔注射后双咖酚酸的组织分布
给药后检测各脏器组织中的药物浓度，结果见表4o说明小鼠腹腔注射双咖酚酸后，双咖酚酸可快速分布到全身主要组织，且在各主要组织中的含量按从高到低的顺序排列为：肾〉血浆>心>脾>肺〉肝。但在2h后，肝和肾已检不出。
52烟台大学学报（自然科学与工程版）第34卷
表2双咖酚酸在组织液和血浆中的稳定性（"=5，士s）
Tab.3Stability of bispheaolic acid in tissue and blood(n=5，土s)
组织液
室温即时检测25£,h6£,d-20£,1w
测量值/
(M.-m L_1)
RSD/
%
测量值/
实名认证系统（临-mL）
RSD/
%
测量值/
（临-mL"）
RSD/
%
测量值/
（-mL"2）
RSD/
% 0.46±0.05712.40.45±0.06】2346043±040666470466±040622642
心 5.11±0.4860.06476±0457022426476±0432********±04322643
67.35±6.233 6.067.77±5.⑵204745.H±3.12264066433±34335742
0.01±0.06212.20.81±0.05522460.46±0.05422470460±04036743
肝544.±0464. 6.15426±042005466467±0452522405422±04260546 50016±40262 6.067433±643200.367466±2467064050422±543252046
006.±0006.12.30466±0406726460452±0406622470466±040562247脾502.±0051104647±04620406402±046266476467±04636040 66045±602260.466422±340264667466±3422264667426±64222640
0052±0006612.70.46±0.0572*******±0406223460452±04066040肺5026±006.10.4 6.66±0.3767466462±0436********±04376742
55.37±5.48912.050.32±5.480204052422±2422264267426±542002046
0054±0006211.70450±0405620460467±040377400452±040632246肾6066±004467.3 6.79±0.4760405426±042635406463±04260640
47.36±3.079 6.465476±346064553427±3426264067422±64567047
0.46±0.05612.20465±040226400456±0405620460465±040662647
血浆 5.26±0.433 6.35403±0433********±0436********±04666046
52.37±2.89054550426±6427664566436±3423364650425±642222242
表4双咖酚酸在小鼠体内的药代动力学参数
Tab.3Pharmacokinetic parameters of bisphenolic acid in
mouse
药动学参数参数值
£ma/h04063
C ma/(m.-L-)264667
£/2z/h74076
AUC(0-<)/(mg-h-L-)22426
AUC(0-8)/(mg•h•L"2)25467
Vo/(L•kg~2)4206 CL(L•h-•kg-)04076 MRT0-)(h400 MRT(0-8)/h64606
t/h
图4腹腔注射后双咖酚酸的平均血药浓度-时间曲线Fig.3Mean blook couceetrabou-time curve of bispheeoUc acid bter peritoueai
injectiou
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