含银微载体及其在伤口愈合中的应用



1.本发明涉及一种由生物材料制造的医疗器械,尤其涉及一种具有多孔结构的含银微颗粒,其上负载外泌体,用于促进伤口,尤其是糖尿病患者伤口的愈合。


背景技术:



2.创面愈合障碍,尤其是糖尿病创面,是一个临床难题,复发率高和经济负担巨大,导致非创伤性下肢截肢和高死亡率。糖尿病伤口愈合不良的确切病理机制尚不清楚,先前的研究表明,血管生成受损、易受细菌感染和神经病变是加重该并发症的主要因素。此外,由于活性氧(ros)的过度产生和管理不当而导致的过度氧化应激也在创面修复不良中发挥关键作用。这种有害的氧化应激创面微环境引发糖尿病创面中生长因子、内源性干细胞和核酸被破坏,从而潜在地损害其再生能力。重要的是,值得一提的是,由于ros介导的氧化应激阻碍血管生成反应,导致内皮功能障碍,因此受损的血管生成和过度的氧化负荷相互补充。因此,开发多功能ros响应性生物相容性材料,可重塑氧化创伤微环境并促进糖尿病创伤的血管生成,是被广泛认可的。
3.为了糖尿病创面并加速创面愈合,最近开发了各种抗菌剂,包括纳米酶、过渡金属络合物、银纳米颗粒(agnps)、生长因子、一氧化氮、阳离子聚合物、氧化锌纳米纤维等。其中,agnps由于其广谱抗菌活性和低细菌耐药性风险而获得了相当大的研究吸引力,并被广泛应用于开发难愈合创面的高级敷料。尽管agnps的确切抗菌机制尚不清楚,但据报道,agnps释放的银离子(ag
+
)通过使呼吸酶失活,通过干扰dna复制和破坏细胞膜而触发抗菌作用。然而,由于agnps的剩余核心对重要器官的固有毒性作用,基于ag
+
的抗菌剂被开发为ag
+
来源,并被用作agnps抗菌应用的潜在替代品。尽管令人兴奋,但无论疾病微环境如何,这些材料都呈现不可控的ag
+
释放和持续释放状态,导致选择性差和对健康组织的非靶向性毒性。此外,最近的实验室研究表明,过量使用ag
+
可能诱发耐药性,并造成不良的全身效应,包括口服毒性和肝、肾损伤。因此,通过氧化应激反应性抗微生物剂应用疾病特异性靶向方法,仅在病变区域精确和选择性地释放生物活性ag
+
,将有利于糖尿病伤口愈合。
4.外泌体(exosomes,exos)是一种内源性细胞外囊泡的亚型,直径约为 40nm~160nm。由于其特性,如:易于储存、高稳定性和低免疫活性风险,它们最近已成为各种临床并发症的潜在诊断和剂,包括:癌症、皮肤损伤、神经变性、血管功能障碍、自身免疫和炎症疾病。先前的研究表明,不同来源的外泌体可以优化成纤维细胞的功能和促进血管生成,从而加速伤口愈合。尽管外泌体对伤口愈合有很好的效果,但仍然面临一些临床挑战,如:半衰期短和体内快速清除(通过淋巴或网状内皮系统)。另一方面,不利的疾病微环境,如:糖尿病伤口的过度氧化应激微环境,触发了外泌体的快速破坏和失活。因此,很难保证外泌体持续递送到靶组织。此外,由于游离外泌体不能长时间存活,它们的功能可能在伤口再生过程中受损。因此,保护外泌体免受氧化变性,局部递送至靶组织和持续释放对于实现具有改善性能和减少副作用的糖尿病伤口管理至关重要。


技术实现要素:



5.本发明的一个目的在于提供一种含银微载体,具有对环境ros响应而释放ag
+
的功能,降低组织毒性,利于在创面应用,促进愈合。
6.本发明的另一个目的在于提供一种含银微载体,用于负载外泌体,利于提高外泌体对氧化变性的抵抗,改善外泌体在不利微环境中的稳定性,避免外泌体被快速破坏而失活。
7.本发明的再一个目的在于提供一种含银微载体的应用,利用其在病理性氧化环境中生成ag
+
的特性,而作为探针区分病变组织和健康组织。
8.本发明的又一个目的在于提供一种含银微载体,在制备用于糖尿病创面,促进愈合的医疗器械中的应用。
9.本发明提供一种含银微载体,包括抗坏血酸、ag
+
和包被剂,包被剂选自于乳铁蛋白、蛋清、人血清白蛋白和牛血清白蛋白。
10.另一种含银微载体,人血清白蛋白和牛血清白蛋白为包被剂,以取得“花朵样”微颗粒。微颗粒粒径范围700nm~800nm,表面积106.5m3/g
±
20m3/g,具有介孔特性,孔径范围为5nm~225nm。微颗粒具有晶格边缘距离,四个xrd的2θ角特征峰,即:111
°
、200
°
、220
°
和311
°

11.另一种含银微载体,其以如下步骤制得:
12.ag
+
与包被剂于4℃~60℃混合,逐滴抗坏血酸溶液,充分搅拌后,离心收集即得。
13.其中,ag
+
选自于agcl、agno3、ag2co3和ag2so4等银的无机盐作为银离子供体或银的有机盐作为银离子的供体,使得ag
+
浓度为1mm~100mm;
14.包被剂选自于人血清白蛋白和牛血清白蛋白之一种或几种,浓度为 1mg/ml~10mg/ml;
15.抗坏血酸的加入量5mg~500mg。
16.反应温度优先选择60℃,以利于获得介孔特性的含银微颗粒。
17.特别发现,本发明的含银微颗粒,在健康组织环境中无ag
+
释放,不具有抗菌作用。但在环境中提供氧自由基(如:h2o2),则能检测到ag
+
释放,即表明微载体具有环境ros响应而释放ag
+
的特性。一方面,对生物体给予微载体后能降低ag对正常组织的毒性;另一方面,以此含银微载体为探针实现区分病变组织和健康组织,即当检测到ag
+
时,表明组织环境中的ros显著增加,组织可能发生病变,当病变组织检测到ag
+
信号下降时,表明病变组织趋于愈合。
18.一种医疗器械,其以本发明的含银微载体为探针,获取ag
+
信号,如:电信号和溶度信息等。
19.通过调节制取的温度可以获得表面的斑块密集度不同的含银微载体,适用于负载不同规格的生物大分子,比如:多肽、细胞因子、抗体和外泌体等,以此将生物大分子递送至靶组织,且对ros正常的组织不产生毒性。
20.一种组合物,包括本发明的含银微载体,其上负载外泌体,以此提高外泌体对氧化变性的抵抗,改善外泌体的稳定性,避免外泌体被快速破坏而失活。
21.将此组合物递送至创面,尤其是难愈合创面,如:糖尿病创面,有效地消除细菌并促进受损氧化细胞的凋亡,从而改善再生微环境,并在靶位点的局部递送和持续释放,调节
成纤维细胞的功能,促进血管生成。
22.本发明的组合物还加入其它各种辅料制成有利于给药(drug delivery)的剂型,如:但不仅限于片剂、贴剂、栓剂、乳剂、霜剂、凝胶剂、颗粒剂、胶囊剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、缓释剂和控释剂等。此外,还可以为实现特定的给药目的或方式,如:缓释给药、控释给药和脉冲给药等,而使用的辅料,如:但不仅限于明胶、白蛋白、壳聚糖、聚醚和聚酯类高分子材料,如:但不仅限于,聚乙二醇、聚氨酯、聚碳酸酯及其共聚物等。所称的“有利于给药”的主要表现有:但不仅限于提高效果、提高生物利用度、降低毒副作用和提高患者顺应性等。
23.一种水凝胶,包括本发明的组合物胶原,即exo@agnfs增强型可注射水凝胶 (exo@agnf/col)通过促进血液灌注、组织肉芽化、胶原沉积、新生血管化、血管生成和再上皮化,在糖尿病小鼠切除伤口硅胶夹板模型中显著加速体内伤口愈合和再生。
附图说明
24.图1为agnf形态特征图;其中:a为使用乳铁蛋白、蛋白和bsa作为模板合成的agnp的sem图像及放大图像(插入图);b为4℃和60℃制得agnps@bsa扫描电镜图,i~iv表示观察倍率由低至高;
25.图2为agnf颗粒的制备及表征图,其中,a为agnf的逐步合成过程的方案;b 为agnf的sem图像和相应的高分辨率图像;c为hrtem图像和agnf的选区电子衍射(saed)图;d为agnf在有或没有h2o2的pbs缓冲液中孵育不同时间后的sem 图;e表示分散在h2o2溶液中ag离子释放曲线图;f表示不同反应温度下bsa和agnf 的ftir光谱图;g为agnfs的孔径分布曲线图,其中插图为n2吸附/解吸等温线;
26.图3为花朵样agnf用于促进糖尿病伤口愈合实施及其结果图;其中,a为糖尿病小鼠切除夹板非收缩性伤口示意图(左)和照片(右),通过缝合固定无菌聚乙烯防止伤口收缩;b为使用系统递送的l-012试剂在第3天对伤口的体内成像图,与对照wt小鼠相比,db/db小鼠伤口中的ros累积增强**p《0.01;c为在组织切片中使用 dcf-da的ros免疫荧光图,在糖尿病伤口中心有高ros表达,白线标记的范围为伤口;d为从伤口和邻近组织收集的细胞的基于流式细胞分析术的ros分析图;e为来自db/db和wt小鼠的成纤维细胞的western印迹结果,慢性高血糖损害了抗氧化酶sod2、cat和nqo1;f为促进糖尿病伤口愈合的糖尿病伤口特异性靶向纳米递送策略的示意图;
27.图4为氧化微环境中agnf诱导的细胞增殖和凋亡行为结果图;其中,a为agnf 对细胞活力的影响图;b为不同浓度h2o2中用agnf处理的成纤维细胞的cck-8测定结果图;c为用agnf处理的成纤细胞的基于流式细胞术的凋亡测定,*p《0.05;d 为采用双免疫荧光染法在糖尿病伤口再生区域进行ros和tunel测定的非共定位图;e为agnf体外诱导糖尿病成纤维细胞特异性凋亡的示意图和免疫荧光图像,将来自db/db和wt小鼠的成纤维细胞与agnf共培养并孵育24小时,蓝圆圈突出显示从wt小鼠收集的成纤维组织,红圆圈突出显示从db/db小鼠收集的成纤维细胞,在共培养前用cm-fda(绿)标记;
28.图5为合成和表征含exo@agnf/col水凝胶结果图;其中,a为制备外载agnf 的物理吸附方案图;b为外泌体的特征tem图;c为wb测定的特殊标记;d为成纤维细胞吸附cm-dil(红)标记的外泌体的代表性免疫荧光图;e为通过clsm检测载于agnf上的exos图;f为
exo@agnf复合材料的exos释放动力学图;g为胶原和exo@agnf/col水凝胶的光学图像;h为exo@agnf/col的三维(3d)clsm图像,其中胶原用异硫氰酸荧光素(绿)标记exo@agnfs用cm dil(红)标记;i为 cck-8测定在具有不同浓度agnf的agnf/col水凝胶上培养1、3和5天后的成纤维细胞活力结果图,**p《0.01;j为col和agnf/col水凝胶上成纤维细胞生长的sem图像;
29.图6为agnf保护外泌体免受有害的氧化变性,并促进体内新生血管形成结果图; a为adsc-exos对功能性血管生成作用的示意图;b为通过qrt pcr分析确定趋化细胞因子基因pdgf、vegf和hif-1α的表达水平;c为用exos刺激后huvec的小管形成图;d为光学显微镜显示agnf组中存在气泡的图像;e为h2o2处理后agnf对2ab apc 的生物大分子保护能力;f为h2o2处理前后exos和agnf的clsm图像;g为ldi 用于客观评估指定后伤口的实时血流结果图,白圆圈标记的为伤口;h为使用系统软件分析相对流动强度图;i为在第14天处死所有小鼠,收集伤口样本进行cd31 免疫组化染图,*p《0.05,**p《0.01;
30.图7为exo@agnf/col用于体内功能性糖尿病伤口再生评价结果图;其中,a为实验设计的示意图;b为指定后伤口的动态变化数字图像,在伤口周围缝合硅环以抑制收缩,并将水凝胶放置在腔室中(环的内径为8mm);c为以初始伤口面积的百分比量化伤口闭合;d为masson’s染图;e为后14天伤口组织的定量染图; f为ck14和α-sma双染组织切片的代表性共焦图像;g为每个高倍镜sma和ck14 表达的定量,*p《0.05;
31.图8为agnf颗粒xrd结果图;
32.图9为水平western blotting对24小时后不同处理的凋亡途径相关蛋白切割的caspase 3 表达结果图;
33.图10为exo@agnf/col对糖尿病伤口微环境的优化影响结果图;其中,ki 67的免疫组化以评估伤口组织的增殖(顶行);inos(红)和f4/80(绿)联合免疫标记以评估促炎性m1巨噬细胞(第二行)的分布,cd206(红)与f4/80绿联合免疫标记评估促分解 m2巨噬细胞的分布;
34.图11为创伤愈合过程中α-sma表达的动态变化观察图;
35.图12为皮肤基质免疫组织化学染图;
36.图13为col和exo@agnf/14天后组织表面的sem图。
具体实施方式
37.以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
38.本发明以下实施例所用的各项试验方法具体说明如下:
39.1)制取“花朵样”银纳米颗粒(agnf)
40.图2a说明了合成agnf的步骤,其具体方法为:在60℃静态水浴中搅拌5分钟,混合agno3(sigma-aldrich,10mm)和bsa(sigma-aldrich、5mg/ml)的水溶液。接下来,通过搅拌10分钟逐滴添加抗坏血酸(sigma-aldrich,50mg),并在搅拌下保持2 小时,直到反应溶液变暗,表明合成了agnf。然后通过离心(8000rpm,15分钟)分离所得纳米颗粒,并在去离子水
中洗涤三次。利用sem和tem对agnf纳米颗粒的形貌进行表征。通过xrd和ftir光谱进一步分析化学成分。使用asap 2020表面积和孔隙度分析仪(micromeritics instrument corp)测定表面参数,包括表面积和孔径。
41.2)体外真皮成纤维细胞培养
42.在无菌条件下收获小鼠背部伤口或完整皮肤。将组织切成2mm2块,在pbs中洗涤三次,并在4℃下用0.6u/ml dispase ii(sigma)消化12小时。从组织中手动移除表皮,并基于胶原酶消化法分离成纤维细胞。培养成纤维细胞并扩增至第2代,用于后续实验。
43.3)adsc外泌体的制备和细胞摄取研究。
44.从上海交通大学医学院附属第九人民医院整形外科收集的脂肪组织中提取人脂肪源性干细胞(adsc)。在补充10%fbs和1%青霉素/链霉素的dmem中培养adsc,并扩增至第2代以提取外泌体。达到70%-80%汇合后,用磷酸盐缓冲盐水(pbs)冲洗 adsc两次,并在无血清培养基中培养48小时。从条件培养基中分离和纯化adsc-exos (stem cell res ther 2018,9(1),318),并将获得的exos储存在-80℃下供进一步使用。进行nano-sight、tem和western印迹分析以确认exos的提取。
45.红膜染料cm-dil用于标记分离的adsc外泌体。成纤维细胞与cm-dil标记的外泌体(30μg/ml)孵育12小时。用pbs洗涤两次后,用多聚甲醛(pfa)固定细胞,并用荧光phalloidin染。最后,使用共焦激光扫描显微镜(clsm)测定成纤维细胞对cm-dil标记的外泌体的摄取。
46.4)exos加载和释放研究。
47.exo@agnf通过物理粘附制备纳米复合材料。准备exo@agnf,将1mg exos溶液加入10ml agnf悬浮液(1mg/ml)中,并在4℃下孵育12h,每2h轻轻振荡一次。准备 exo@agnf在clsm下观察纳米复合物,以确定标记的外泌体的成功负载。透析袋法观察外泌体从exo@agnf的释放。简言之,10毫升exo@agnf将纳米复合材料添加到透析袋中。然后,在搅拌下将袋漂浮在新鲜的ddh2o(释放介质)中。蛋白质分析试剂盒检测到在12小时、24小时、48小时、3天、5天、7天和10天时外泌体释放到溶液中 (bca,beyotime,中国)。释放曲线计算并显示为释放百分比和时间。
48.5)细胞内活性氧的测定。
49.使用2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(dcf-da;sigma-aldrich,美国)定量测定来自db/db和wt的成纤维细胞的ros水平。收集的成纤维细胞在培养箱中与5mg/mldcf-da孵育20分钟,随后,通过流式细胞仪(英国贝克曼库尔特)和荧光显微镜分析细胞。
50.6)agnf的细胞毒性。
51.成纤维细胞以1
×
104/孔的密度接种到96孔培养板中,并用不同浓度的agnf或 agno3溶液孵育24小时。随后,通过活/死试验(invitrogen,美国)评估细胞存活率,并计算存活率。
52.7)评估不同h2o2溶液中agnf诱导的成纤维细胞代谢变化
53.成纤维细胞用50μm agnf培养,然后向培养基中加入一系列浓度在50~500μm范围内的h2o2溶液,并孵育3、7和10天。细胞代谢活性通过细胞计数试剂盒-8(cck-8) (dojindo,日本)测定法进行评估,该测定法基于在450nm处的吸光度,使用微孔板读取器(thermofisher nanodrop 2000,美国)。
54.8)agnf对体外细胞凋亡的影响
55.成纤维细胞以2
×
105/孔的密度接种到12孔培养板中,并在37℃孵育24小时。然后加入agnf和h2o2并进一步孵育24小时。根据制造商的说明,应用凋亡检测试剂盒 (thermo scientific,waltham,ma,usa)通过流式细胞术测定细胞凋亡。将成纤维细胞重新悬浮在1
×
膜联蛋白结合缓冲液(100μl)中,然后避光与5μl annexin v和1μl 碘化丙啶(pi,100μg/ml)孵育。在室温下孵育30分钟后,通过流式细胞仪分析细胞凋亡。
56.9)agnf的生物药物保护效果评估。
57.为了评估agnf的生物药物保护效果,将agnf与2ab apc孵育2小时,然后用h2o2溶液处理。结合2ab apc的荧光强度使用m3微板读数光度计进行定量。 agnf也与cm-dil(红)标记的exo一起孵育,并用共焦激光扫描显微镜观察exo的结合。
58.10)载exo-agnf的col水凝胶的制备和体外细胞毒性试验。
59.col溶液(1.5wt%溶于0.1m乙酸中)和exo@agnf将不同比例的溶液在磁力搅拌下混合30分钟以获得均匀混合物。然后,将溶液的ph调节至中性,以便于注射和凝胶化。用于表征exo@agnfcol水凝胶中的颗粒,exo@agnf/col构建体使用标记 exo@agnf(cm dil标记的exos)和alexa488标记的胶原水凝胶。凝胶化后,荧光exo@agnf/col构造在clsm上可视化。
60.11)硅胶夹板切除伤口模型
61.使用硅胶夹板切除伤口模型评估exo@agnf/col水凝胶皮肤再生潜力。麻醉小鼠后,用电动剪子刮去背部毛发,用75%乙醇擦干。将8周龄的遗传性糖尿病小鼠(db/db) 驯化1周,并用血糖仪测量其血糖浓度,以确认手术前一天这些小鼠的糖尿病状态。对于手术切除伤口,用异氟醚麻醉糖尿病小鼠。在背侧表面进行全厚度切除(直径6mm),并在伤口周围缝合并固定硅胶支架。将50μl水凝胶注入室中。将造模的糖尿病小鼠随机分为五组(n=5):空白对照(pbs缓冲液)、col组、exo/col组、agnf/col组以及 exo@agnf/col。
62.12)通过ldpi评估伤口的实时血流。
63.在术后第3、7和14天,使用激光多普勒灌注成像(ldi)分析仪(moor instruments, axminster,uk)对每个伤口进行血流灌注分析。在距伤口区域恒定距离处使用精确的扫描区域尺寸拍摄图像。每个伤口的血流结果以任意单位表示。
64.13)体内伤口再生的评估
65.通过评估伤口面积量化伤口闭合率。用数码相机(尼康)每2天记录伤口的照片,然后用imagej软件(美国国立卫生研究院)评估以计算伤口面积。14天后,在全身麻醉下对动物实施安乐死,收集伤口和邻近皮肤,并将其固定在4%pfa中,随后进行masson三染。
66.进行免疫荧光染以定量分析新形成组织的sma和ck14的表达。简言之,将皮肤切片(6μm)与抗sma(1:300,abcam)和ck14(1:1000,abcam)的一级抗体在4℃孵育过夜。用pbs洗涤3次后,用相应的488或594alexa fluor荧光二抗(invitrogen)孵育切片。clsm评估荧光。对样品的不同区域进行成像,并计算来自三份样本的平均免疫荧光。
67.13)统计分析
68.所有数据均表示为平均值
±
标准差。使用graphpad prism(graphpadsoftware)进行统计分析。学生t检验分析两组之间的比较;否则,进行单因素方差分析(anova),然后进
行tukey的事后多重比较检验。
69.实施例1表征agnf
70.不同的生物分子,包括:乳铁蛋白、蛋清和牛血清白蛋白(bsa)被用作辅助模板,这导致形成具有不同形态的agnp,从圆盘到纳米针状物和纳米花,如图1a所示。由于大的比表面积可以为生物大分子的吸附提供更多的结合位点,因此选择了具有花状形态的agnp用于随后的生物医学应用。
71.为了进一步优化agnf,还分析了一系列参数(如:ag、bsa和抗坏血酸的不同浓度,以及ph值和反应温度)(图1b)。如图1b所示,制备的agnf显示出均匀的球形形态,直径约700~800nm,胶体分散性良好。值得注意的是,通过将反应温度从 60℃降低到4℃,agnf表面的斑块变得更密集,这提供了更多的结合位点。
72.单个纳米颗粒的高倍率sem图像显示了具有多层结构的粗糙表面,类似于花朵形状(图2b),其中每个花瓣具有高度介孔纳米结构。因此,在随后的实验中选择了这样一种可以为exos吸附提供更多结合位点的介孔结构。通过高分辨率透射电子显微镜(hrtem)测定agnf的结晶度(图2c)。花瓣的晶格分辨hrtem图像(标记为正方形区域)显示晶格边缘距离,对应于ag(来自jcpds 65-2871)单晶面心立方结构中(111)面之间的d间距。选区电子衍射(saed)分析还表明,每个花瓣都是单晶突起。agnf是多晶的,有许多不同方向的花瓣。x射线衍射(xrd) 光谱观察到四个典型的衍射峰,进一步证实了agnfs的晶体结构,对应于ag晶体的 (111)、(200)、(220)和(311)晶面(图8)。此外,没有观察到任何杂质的特征衍射峰,表明agnf系高纯晶体。代替使用有毒赋形剂,agnf通过生态友好的方法合成,具有结构稳定性、大比表面积和优异的生物相容性等优点。
73.实施例2ros依赖性纳米颗粒分解
74.在存在或不存在h2o2的情况下,在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中孵育agnf,并在不同时间点进行sem成像(图2d)。在不存在h2o2的情况下,agnf即使在pbs溶液中孵育6小时后也没有显示任何形态变化,表明在生理环境中具有良好的稳定性。相反,在h2o2溶液(1mm)中观察到agnf分解成小薄片的时间依赖性。接下来,进一步研究了ag离子(ag
+
)的释放曲线,以确定h2o2环境下agnf的降解速率(图2e)。与agno3相比,agnf在12天内表现出可忽略不计的ag
+
释放。然而,h2o2预处理显著加速了12 天后ag
+
的释放(2.0%至39.2%),这表明agnf的ros响应降解行为。这一结果表明, agnp通过释放活性ag
+
离子获得抗菌活性,这些活性ag
+
离子与生物分子中的电子供体基团强烈结合。傅里叶变换红外光谱(ftir)显示o-h和n-h拉伸振动峰位于 3415cm-1
,蛋白质带位于1650cm-1
和1540cm-1
(图2f),证实了银纳米纤维表面存在bsa。因此,由于bsa的ros消耗能力,使用bsa作为辅助模板的agnf被认为仅在暴露于过度氧化应激时才调节反应性ag
+
从“关闭”到“开启”状态的生成。通过n2吸附-解吸等温线分析agnf的表面积和孔径分布(图2g)。特征曲线表明agnf的 brunauer-emmett-teller(bet)表面积(106.5m3/g),孔径范围为5nm~225nm。如此大的表面积的分级介孔agnf有利于负载生物大分子。
75.实施例3伤口微环境活化纳米给药促进糖尿病伤口愈合
76.首次探索了糖尿病小鼠受损皮肤组织的微环境特征,确切地说是异常ros水平。为此,我们在转基因糖尿病小鼠(db/db)中创建了6mm全层皮肤缺损的糖尿病伤口 (图3a),而在第3天使用系统递送的l-012试剂进行体内荧光成像以实时跟踪ros 累积。图3b显示了主
要在野生型(wt)和db/db小鼠伤口区域的特异性ros积累。相反,定量分析证实,db/db伤口显示出比wt伤口高3.76倍的生物发光强度。重要的是,使用特定ros探针(2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯,dcf-da)的免疫荧光分析表明,db/db小鼠的完整组织中的ros较高,如图3c所示。在皮肤损伤后,db/db 和wt小鼠的损伤组织呈现出增强的ros水平,如强绿荧光所示,而前者与wt小鼠显示出显著差异。
77.接下来,从wt和db/db小鼠的完整组织和伤口区域收集细胞,以表征细胞内氧化应激水平。与wt小鼠相比,流式细胞术分析证实了db/db小鼠伤口组织中较高的细胞质ros生成,因为伤口组织中68.5+4.7%的成纤维细胞含有ros,而完整组织中 30.1+1.9%的成纤细胞含有ros(图3d)。
78.进一步评估了控制细胞环境中ros水平的必需抗氧化酶,如:还原型辅酶1 (nqo1)、超氧化物歧化酶(sod)和过氧化氢酶(cat)的激活。western blot(wb) 分析表明,db/db创伤小鼠中nqo2、sod和cat的表达与正常对照组相比有所减少 (图3e)。这些数据表明,糖尿病高血糖条件损害氧化还原稳态,并导致db/db伤口微环境中的高ros活性,这可用于区分病变组织和健康组织。
79.因此,ros激活的agnf被制造以增强糖尿病伤口愈合。由于高比表面积和大孔径,agnf还可作为可控递送外泌体的平台,如图3f所示。暴露于氧化条件后,agnf 通过消耗细胞内ros分解成ag+离子,并释放外泌体以优化再生微环境。值得注意的是,通过有效清除糖尿病伤口环境中过量的ros,agnf还促进了外泌体对氧化变性的抵抗。
80.实施例4h2o2反应性agnf的体外活性
81.首先通过活/死试验检测agnf对成纤维细胞的潜在细胞毒性。如图4a所示,ag
+ (0.05mm)在孵育24小时后,即使在低浓度(约15%存活率)下也会诱发严重的细胞毒性,而agnf处理的成纤维细胞呈现出》95%的细胞存活率,这意味着agnf比 ag
+
更稳定和更安全。对于随后的实验,使用0.05mm浓度的agnf。接下来,我们通过cck-8分析检测了在h2o2(0.05mm~0.5mm)存在下agnf的细胞毒性。在0.3mmh2o2浓度下,agnf处理的成纤维细胞在第3天的代谢活性略有下降(10.0%)(图 4b),而在第7天(62.8%)和第10天(64.4%)分别显著下降。这些结果与先前的研究一致,这些研究表明过度氧化应激可显著损害修复细胞的再生潜能。进行流式细胞术评估以分析agnf诱导的成纤维细胞凋亡(图4c)。已经注意到,agnf略微增加成纤维细胞凋亡,这在h2o2处理下更为明显。
82.此外,如wb所示,在agnf+h2o2组中,凋亡相关的caspase-3蛋白表现出上调表达(图9)。与agnf+h2o2处理相反,用h2o2预处理细胞以模拟受损的成纤维细胞。表明agnf可以增强细胞凋亡,而不管h2o2处理的类型。
83.此外,通过分析涉及受伤皮肤的组织凋亡,使用双免疫荧光染发现tunel和 ros的非共定位。在伤口再生较好的区域观察到较强的tunel和较弱的ros染(图 4d),这意味着适度的细胞凋亡可以优化氧化微环境。因此,进一步验证agnf是否可以增强受损氧化细胞的凋亡,以避免更严重的坏死,从而加速伤口修复。agnf体外诱导ros特异性细胞凋亡图如图4e所示。将来自db/db糖尿病小鼠伤口的成纤维细胞显示出强烈的ros染。将先前用cm-fda标记的db/db成纤维细胞与来自正常 c57小鼠的成纤维细胞共培养,然后与agnf孵育24小时。在亮场图像中,正常成纤维细胞及其db/db对应物分别用蓝和红圆圈标记。共聚焦激光扫描显微镜(clsm) 图像表明,在孵育24小时后,agnf诱导的凋亡(tunel红荧光
染)主要发生在 cm-fda标记的细胞中。由此证实,当生理条件改变为病理性氧化环境时,agnf可以从“关闭”状态切换到“开启”状态以生成ag
+
,消除细菌并增强受损氧化细胞的凋亡,从而改善再生微环境。
84.实施例5外泌体负载agnfs可注射水凝胶
85.图5a示意性地说明了agnf的外泌体递送。从人脂肪来源干细胞(adsc)的条件培养基中分离和纯化外泌体。tem成像表明,外泌体的典型杯状形态,直径约为 100nm,通过纳米镜分析证实(图5b)。尽管wb分析显示缺乏内质网蛋白钙连接蛋白,但外泌体相关标记cd63和tsg101证实了外泌体的成功分离(图5c)。由于外泌体通过内吞作用与靶细胞相互作用,在细胞间通讯中发挥了重要作用,荧光共聚焦显微镜显示,12小时后,cm-dil标记的外泌体在成纤维细胞细胞质中成功内吞(图 5d)。
86.为了验证agnf是否可用于负载外泌体,将agnf与cm-dil标记的外泌体孵育2 小时,然后收集用于荧光检测。如图5e所示,cm-dil标记的外泌体静电(非共价) 结合在agnf表面,这允许外泌体缓慢释放(图5f)。选择i型胶原(皮肤和结缔组织中最丰富的胶原)形成可注射水凝胶。之前的报告还表明,col可以通过调节ph、温度和电解质浓度自组装成螺旋状纳米纤维,形成水凝胶。
87.通过调节ph(ph=7.0)形成col水凝胶,并且加入agnf不会影响col的凝胶化。制备的可注射agnf/col水凝凝胶从白变为灰(图5g)。agnf/col的3d clsm 图像显示了用cm dil标记的agnf的均匀分布(图5h)。
88.接下来又评估了成纤维细胞在一系列agnf/col水凝胶上的代谢活性和存活率。对于体内研究,agnf的浓度设置为10μg/ml,因为在较低浓度下,agnfs不会引起显著的细胞毒性(图5i)。成纤维细胞在agnf/col上培养3天,并通过sem进行检查。sem图像显示,col和agnf/col水凝胶均具有良好的细胞相容性,培养的成纤维细胞呈球形。值得注意的是,由于水凝胶中纳米颗粒的均匀分布,agnf/col水凝凝胶显示出更不均匀的表面(图5j)
89.实施例6外泌体对体外氧化变性和新生血管形成的保护作用
90.最近的研究表明,血管生成对于增强糖尿病伤口修复至关重要。一些趋化因子,如:血小板衍生生长因子(pdgf)、血管内皮生长因子(vegf)和缺氧诱导因子-1(hif-1α) 已被证实在血管生成中发挥重要作用(图6a)。实时定量逆转录聚合酶链反应(qrtpcr)测定了这些趋化因子在外泌体处理的huvec中的表达。用exos2天后,结果显示huvec中pdgf、vegf和hif-1α的表达增强(图6b)。此外,如体外小管形成试验所示,外泌体的添加进一步促进毛细血管样结构的形成(图6c)。总之,这些结果证实了adsc exos的促血管生成作用;然而,由于糖尿病伤口氧化变性的不利影响,体内验证是必要的。
91.在体内研究之前,测试了agnf在pbs(pbs+h2o2)溶液中触发h2o2催化分解的催化能力。与h2o2溶液相比,光学显微镜显示agnf+h2o2组中明显产生氧气泡(图 6d)。由于有害的活性氧被agnf有效地“清除”,即agnf可以保护封装的生物分子免受不利的氧化损伤。
92.将agnf与别藻蓝蛋白标记的二级抗体(2ab apc)一起孵育。定量荧光检测表明,与单独的2ab apc(37.93%)相比,agnf对2ab-apc(85.47%)提供了特殊的保护,使其免受h2o2催化分解引起的h2o2诱导的氧化损伤(图6e)。此外,agnf 和cm-dil标记的外泌体在4℃下孵育2小时,以确保成功结合。h2o2暴露后,cm-dil 标记的外泌体显示荧光明显降低;然而在agnf内封装之后,exo@agnfs显示了h2o2处理前后可忽略的荧光变化(图6f)。
93.实施例7体内新生血管形成exo@agnf-loaded胶原水凝胶
94.在愈合受损的db/db糖尿病小鼠上创建切除伤口,并随机分为(i)未(nc) 或单独使用(ii)胶原(col),(iii)exo/col,(iv)agnf/col和(v)exo@agnf/col 组。使用激光多普勒成像(ldi),在第3天、第7天和第14天实时检测伤口血液灌注,如图6g所示。在早期时间点(第3天),col和exo/col组的血液灌注略高于nc 组,这与之前的研究一致,表明基于生物大分子的组织工程的主要瓶颈是敌对疾病微环境中的生物大分子的快速分解和失活,随着agnf的加入,agnf/col和 exo@agnf/col组实现了更好的血液灌注。在第7天和第14天,exo@agnf/col显示出与其他四组的显著差异。尽管两个胶原水凝胶处理组在稍后的时间点呈现增加的血液灌注,exo@agnf/col组表现出最高的通量强度。在第14天,通量强度约为 exo@agnf/col组比nc组更明显(图6h)。
95.第14天对伤口组织的免疫组化分析显示,伤口组织中有更多的cd31阳性细胞 exo@agnf/col组的血管面积明显大于其他四组(图6i)。增殖标记物ki67和抗炎标记物cd206分别获得了类似的结果(图10),这意味着exo@agnf优化伤口微环境,刺激体内新生血管。
96.实施例8exo-agnf负载胶原水凝胶体内糖尿病伤口再生
97.研究了exo@agnf负载水凝胶体内伤口愈合性能(图7a)。在伤口周围缝合一个硅环,以抑制由于表面张力引起的皮肤收缩,这可以更好地模拟人类伤口修复过程。水凝胶被放置在腔室中。图7b显示了在不同时间用数码相机拍摄的动态愈合图像。值得注意的是,硅环有效地减少了伤口收缩,伤口愈合主要通过肉芽组织的形成和再上皮化。如图7c所示,exo@agnf/col组在第14天的伤口闭合率明显高于其他四组(nc组为26.3+1.6%,col组为35.0+3.8%,exo/col组46.5+5.8%,agnf/col为 54.5+3.6%,exo@agnf/col组为80.1+8.8%)。
98.然后收集伤口组织进行组织学染。与一般观察一致,masson染显示agnf/col 中广泛的胶原沉积和更显著的胶原纤维厚度exo@agnf/col组比其他组中的多(图 7d)。相比之下exo@agnf/col集团表现出更加有序和规则的安排。此外,上皮间隙在exo@agnf/col比其他四组(图7e)。
99.此外,采用免疫荧光染以分析伤口床中的细胞角蛋白14(ck14)和α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)(图7f)。细胞角蛋白14(ck14)分析评估了功能性再上皮化。 exo/col和agnf/col水凝胶均促进糖尿病伤口的再上皮化,表明比col和nc组的细胞染阳性程度更高的特征。值得注意的是exo@agnf/col组的ck14表达高于其他组(图7g)。这个exo@agnf/col组表现出最厚、组织最完整的表皮和毛发新生。α-sma 被选为肌成纤维细胞标记物。有趣的是,第14天伤口床中exo@agnf/col组的α-sma 染面积显著减少。该结果与报告的文献形成对比,该文献表明,在更好的再生条件下,α-sma表现出最强的荧光强度。
100.测定了正常伤口愈合过程中α-smas表达的动态变化,并在第3天观察了伤口和邻近区域的α-sma表达。随着伤口再生和重建,α-sma的表达随着时间的推移趋于减少(第7天),而在第14天,表达几乎可以忽略不计(图11)。在心肌梗死损伤的修复过程中也观察到类似的结果,其中损伤区域的α-sma表达与正常组织相似,第 14天的exo@agnf/col水凝胶提供了更好的伤口表面再生和重塑。
101.细胞外基质蛋白(ecm)的沉积,如:纤维连接蛋白和胶原,被用来表征成纤维细胞
41。纤维连接素和胶原的免疫染显示,在成纤维细胞中呈强阳性染第14天的exo@agnf/col组,其显著高于其他四组(图12)。此外,在植入后14天收集col 和exo@agnf/col水凝胶进行sem扫描。组织表面的图像显示组织表面更加不平整exo@agnf/col水凝胶,类似于其未处理状态(图13)。

技术特征:


1.一种含银微载体,其特征在于对环境ros响应而释放ag
+
,包括抗坏血酸、ag
+
和包被剂,所述的包被剂选自于人血清白蛋白和牛血清白蛋白;所述的微颗粒呈“花朵样”,表面积106.5m3/g
±
20m3/g,具有介孔特性,孔径范围为5nm~225nm。2.根据权利要求1所述的含银微载体,其特征在于具有晶格边缘距离。3.根据权利要求1所述的含银微颗粒,其特征在于具有四个xrd的2θ角特征峰,即:111
°
、200
°
、220
°
和311
°
。4.根据权利要求1所述的含银微颗粒,其特征在于粒径为700nm~800nm。5.根据权利要求1所述的含银微颗粒,其特征在于以如下步骤制得:ag
+
与包被剂于4℃~60℃混合,逐滴抗坏血酸溶液,充分搅拌后,离心收集即得;其中,ag
+
选自于agcl、agno3、ag2co3和ag2so4之一种或几种银的无机盐作为银离子供体或银的有机盐作为银离子的供体,使得ag
+
浓度为1mm~100mm;包被剂浓度为1mg/ml~10mg/ml;抗坏血酸的加入量5mg~500mg。6.根据权利要求1~5之一所述的含银微颗粒作为载体用于负载和递送外泌体,提高外泌体对氧化变性的抵抗,避免外泌体被快速破坏而失活。7.一种组合物,其特征在于包括权利要求1~5之一所述的含银微颗粒和外泌体,外泌体负载于所述的含银微颗粒上。8.根据权利要求7所述的组合物,其特征在于还包括胶原,制成可注射水凝胶。9.根据权利要求1~5之一所述的含银微颗粒在制备医疗器械中的应用。10.一种医疗器械,以权利要求1~5之一所述的含银微颗粒为探针,并获取ag
+
信号。

技术总结


一种含银微载体,包括抗坏血酸、Ag


技术研发人员:

王贤松 陈亚红 郑志伟

受保护的技术使用者:

上海交通大学医学院附属第九人民医院

技术研发日:

2022.09.23

技术公布日:

2022/11/22

本文发布于:2022-11-24 17:19:32,感谢您对本站的认可!

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标签:细胞   伤口   凝胶   纤维
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